Mikrosomaalne oksüdatsioon on reaktsioonide jada, mis hõlmab oksügenaasid Ja NADPH, mis viib hapnikuaatomi sisestamiseni mittepolaarse molekuli koostisesse ja selle hüdrofiilsuse ilmnemiseni ning suurendab selle reaktsioonivõimet.

Reaktsioonid mikrosomaalne oksüdatsioon viivad läbi mitmed ensüümid, mis asuvad endoplasmaatilise retikulumi membraanidel (juhul in vitro neid nimetatakse mikrosomaalseteks membraanideks). Ensüümid organiseerivad lühikesi ahelaid, mis lõpevad tsütokroom P 450-ga.

Mikrosomaalsed oksüdatsioonireaktsioonid hõlmavad 1. faasi reaktsioonidele ja on loodud hüdrofoobsetele molekulidele polaarsete omaduste andmiseks ja/või selle hüdrofiilsuse suurendamiseks, molekulide reaktsioonivõime suurendamiseks 2. faasi reaktsioonides osalemiseks. Oksüdatsioonireaktsioonides tekivad või vabanevad hüdroksüül-, karboksüül-, tiool- ja aminorühmad, mis on hüdrofiilsed.

Mikrosomaalsed oksüdatsiooniensüümid paiknevad siledas endoplasmaatilises retikulumis ja on segafunktsiooniga oksüdaasid(monooksügenaasid).

Tsütokroom P450

Mikrosomaalse oksüdatsiooni peamine valk on hemoproteiin - tsütokroom P 450. Looduses on selle valgu kuni 150 isovormi, mis oksüdeerivad umbes 3000 erinevat substraati. Erinevate tsütokroom P450 isovormide suhe on geneetiliste omaduste tõttu erinev. Arvatakse, et mõned isovormid osalevad ksenobiootikumide biotransformatsioonis, teised aga metaboliseerivad endogeenseid ühendeid (steroidhormoonid, prostaglandiinid, rasvhapped jne).

Tsütokroom P450 interakteerub molekulaarse hapnikuga ja sisaldab ühe hapnikuaatomi substraadi molekuli, aidates kaasa selle hüdrofiilsuse ilmnemisele (intensiivistumisele), ja teise veemolekuli. Selle peamised reaktsioonid on järgmised:

• oksüdatiivne dealküleerimine, millega kaasneb alküülrühma (N-, O- või S-aatomite juures) oksüdeerimine aldehüüdrühmaks ja selle elimineerimine,
• alifaatsete või aromaatsete tsüklitega mittepolaarsete ühendite oksüdeerimine (hüdroksüülimine),
• alkoholide oksüdeerimine vastavateks aldehüüdideks.

Tsütokroom P 450 tööd tagavad kaks ensüümi:

• NADH-tsütokroom b 5 oksidoreduktaas, sisaldab FAD,
• NADPH-tsütokroom P 450-oksidoreduktaas, sisaldab FMN Ja FAD.

Mikrosomaalse oksüdatsiooni ensüümide ja nende funktsioonide vastastikuse paigutuse skeem

Mõlemad oksidoreduktaasid võtavad vastu elektrone oma vastavatelt redutseeritud ekvivalentidelt ja loovutavad need tsütokroom P 450-le. See valk, mis on eelnevalt kinnitanud redutseeritud substraadi molekuli, seondub hapniku molekuliga. Olles saanud veel ühe elektroni, lisab tsütokroom P 450 esimese hapnikuaatomi hüdrofoobse substraadi koostisesse (substraadi oksüdatsioon). Samal ajal redutseeritakse teine ​​hapnikuaatom veeks.

Substraadi hüdroksüülimisreaktsioonide järjestus, mis hõlmab tsütokroom P450

Mikrosomaalse oksüdatsiooni oluliseks tunnuseks on võime esile kutsuda või inhibeerida, st. protsessi võimsuse muutmiseks.

Induktorid on ained, mis aktiveerivad tsütokroom P 450 sünteesi ja vastava mRNA transkriptsiooni. Nemad on

1. Lai skaala toimed, millel on võime stimuleerida tsütokroom P 450, NADPH-tsütokroom P 450 oksidoreduktaasi ja glükuronüültransferaasi sünteesi. Barbituurhappe derivaadid on klassikaline esindaja - barbituraadid, kuuluvad ka sellesse rühma diasepaam, karbamasepiin, rifampitsiin ja jne.

2. kitsas spekter ja toimingud, st. stimuleerivad ühte tsütokroom P 450 vormi - aromaatseid polütsüklilisi süsivesinikke ( metüülkolantreen, spironolaktoon), etanool.

Näiteks, etanool stimuleerib P 450 2E1 isovormi (alkoholoksüdaasi) sünteesi, mis osaleb etanooli, nitrosamiinide, paratsetamooli jne metabolismis.
Glükokortikoidid indutseerida isovorm P 450 3A.

Mikrosomaalse oksüdatsiooni inhibiitorid seonduvad tsütokroomi valguosaga või heemi rauaga. Need jagunevad:

1. pööratav

• otsenetegevused- vingugaas ( NII), antioksüdandid,
• kaudnetegevused, st. mõju nende ainevahetuse vaheproduktide kaudu, mis moodustavad komplekse tsütokroom P 450-ga - erütromütsiin.

2. pöördumatu inhibiitorid - allopurinool, kloorpromasiin, progesteroon, suuline rasestumisvastased vahendid, teturam, fluorouratsiil,

1. faasi reaktsioonide hindamine

Mikrosomaalset oksüdatsiooni saab hinnata järgmistel viisidel:

• mikrosomaalsete ensüümide aktiivsuse määramine pärast biopsiat,
• ravimite farmakokineetika kohta,
• metaboolsete markerite kasutamine ( antipüriini test).

Antipüriini test

Subjekt võetakse hommikul tühja kõhuga amidopüriin kiirusega 6 mg/kg kehakaalu kohta. Uriini kogutakse 4 portsjonit vastavalt 1 kuni 6 tunni, 6-12, 12-24 ja 45-48 tunni jooksul. Mõõdetakse uriini kogust. Hiljemalt 24 tundi hiljem uriin tsentrifuugitakse või filtreeritakse. Järgmisena uuritakse 4-aminoantipüriini ja selle metaboliidi N-atsetüül-4-aminoantipüriini kontsentratsiooni uriinis.

Tsütokroom P450. Avastuse autorid M. Klingerberg ja D. Garfinkel leidsid, et selle ensüümi võib proteesrühma keemilise olemuse tõttu omistada i-tüüpi tsütokroomidele. T. Omura ja R. Sato leidsid 1964. aastal, et süsinikmonooksiidiga redutseeritud hemoproteiini kompleksil on iseloomulik maksimum 450 nm juures, mis määras ensüümi nimetuse. Kuid sõna "tsütokroom" kasutamist seoses P450 klassi hemoproteiinidega ei saa pidada edukaks, kuna tsütokroomide funktsioon on elektronide ülekandmine, mitte monooksügenaasi reaktsioonide katalüüs. D. Nebertombi esitatud soovitustes P450 perekonna nomenklatuuri kohta mainitakse sõna "tsütokroom" ainult CYP (st tsütokroom Z450) nimetuse dešifreerimisel, mida kasutatakse P450 geenide tähistamisel.

Praegu on teada üle 150 erineva P450, mida leidub loomades, taimedes, seentes ja bakterites. Ainult rangelt anaeroobsetel bakteritel puudub hemoproteiin. Prokarüootid sisaldavad lahustuvat P450. Üleminek eukarüootsetele süsteemidele kaasneb P450 inkorporeerimisega membraani, nagu pärmide ja seente puhul. Kõik kõrgemate organismide tsütokroomid P450 on membraaniensüümid. Evolutsioonilises mõttes on kõige vanem bakteriaalne monooksügenaas

Evolutsiooniredeli vahefaasis on neerupealiste mitokondriaalne hüdroksülaasi süsteem. Sellel on kõik bakteriaalselt lahustuva süsteemi omadused ja see koosneb ka kolmest komponendist. Selle kaks komponenti - FAD-d sisaldav flavoproteiin (NADPH- või NADH-sõltuv reduktaas) ja heemi väävlit mittesisaldav valk (adrenodoksiin) - on vees lahustuvad ja paiknevad mitokondriaalses maatriksis, kolmas - P450 on ehitatud membraani. . Tähelepanu juhitakse mitokondriaalsete hemoproteiinide kõrgele substraadi spetsiifilisusele, mis muudab selle süsteemi veelgi sarnasemaks bakteriaalsega. Mitokondriaalsed tsütokroomid P450 osalevad peamiselt endogeensete substraatide oksüdatsioonis.

Evolutsiooniredeli kõrgeimal astmel on maksa mikrosoomide monooksügenaasi süsteem.

P450-d mängivad olulist rolli paljude ühendite, nii endogeensete (steroidid, sapphapped, rasvhapped, prostaglandiinid, leukotrieenid, biogeensed amiinid) kui ka eksogeensete (ravimid, mürgid, tööstuslikud saasteained, pestitsiidid, kantserogeenid, mutageenid jne) oksüdatsioonis. Viimaseid nimetatakse ksenobiootikumideks.

Vastavalt katalüüsitud reaktsioonide tüübile võib P450 omistada välist tüüpi monooksügenaasidele. Elektrondoonorite (NAD(P)H) juuresolekul on P450 võimeline aktiveerima molekulaarset hapnikku, millest üks aatom viiakse seejärel oksüdeeritud substraadi molekuli ja teine ​​redutseeritakse veeks.

R + AH + O L ROH + A + HO kus R on substraat, ROH on saadus, AH on elektronidoonor.

Tsütokroom P450 poolt katalüüsitud oksügenaasi reaktsioonid on väga mitmekesised. Ksenobiootikumide üks levinumaid oksüdatsioonireaktsioone on oksüdatiivne dealküleerimisreaktsioon, millega kaasneb N-, O- või S-aatomitega seotud alküülrühma oksüdatsioon. Levimuse poolest teisele kohale kuuluvad tsükliliste ühendite hüdroksüülimisreaktsioonid, mis hõlmavad aromaatsete, küllastunud ja heterotsükliliste süsivesinike hüdroksüülimist. P450 võib katalüüsida ka alifaatsete ühendite hüdroksüülimisreaktsioone, N-oksüdatsiooni, oksüdatiivset desamiinimist, aso- ja nitroühendite redutseerimisreaktsioone. Looduslike ühendite oksüdatsioonireaktsioonide hulka kuuluvad küllastunud rasvhapete w-oksüdatsioon, steroidhormoonide, sapphapete ja kolesterooli hüdroksüülimine, prostaglandiinide biosüntees ja küllastumata rasvhapete peroksüdatsioon.

Erinevalt teistest hemoproteiinidest, millel on tavaliselt ainult üks aktiivsus rakus ja rangelt määratletud funktsioon, võib P450 koos monooksügenaasi aktiivsusega avaldada ka oksüdaasi aktiivsust, tekitades reaktiivseid hapniku liike superoksiidi ja hüdroksüülradikaalide, vesinikperoksiidi kujul. Sellega seoses nimetatakse P450 mõnikord kirjanduses segafunktsiooniga oksüdaasiks. A.I. Archakov jt. leidis, et P450 võib toimida ka tõelise neljaelektroni oksüdaasina, genereerides hapnikumolekulist ainult vett. P450 tuvastab ka peroksidaasi aktiivsuse, kasutades oksüdatsioonireaktsioonis kosubstraatidena NAD(P)H asemel orgaanilisi peroksiide või vesinikperoksiidi. On tõendeid, et P450 võib katalüüsida dioksügenaasi reaktsioone. Seega on P450 iseloomulikuks tunnuseks funktsioonide paljusus, kuid peamine on monooksügenaas. Joonisel fig. 1.32 näitab oksüdaasi ja oksüdaasi reaktsioonide üldist skeemi. Oksügenaasi tsükli 1. etapis (tsükkel a) seostuvad substraadid P450 oksüdeeritud vormiga, moodustades ensüümi-substraadi kompleksid. Sel juhul võib olenevalt substraatidest ilmneda kolme tüüpi spektraalseid muutusi: I, II ja modifitseeritud II, mida iseloomustavad diferentsiaalneeldumisspektris teatud lainepikkustel maksimum ja miinimum. I tüüpi substraadid interakteeruvad peamiselt madala pöörlemissagedusega vormiga P450 ja rauaaatom läheb kuue koordineeritud madala spiniga olekust viie koordineeritud kõrge spinni olekusse. Juhtrolli I tüüpi komplekside moodustamisel mängivad mittepolaarsete substraatide hüdrofoobsed interaktsioonid ensüümi aktiivse keskmega. II tüüpi kompleksid tekivad substraadi aminorühma interaktsiooni tulemusena heemi raua aatomiga, mis on kas kõrge või madala spinni olekus. Sel juhul läheb raua kõrge pöörlemiskiirusega vorm üle madala pöörlemiskiirusega vormiks. Heemraud on sellistes kompleksides kuue koordineeritud olekus ja hapniku sidumise koha hõivab substraadi lämmastik. Modifitseeritud II tüüpi spektraalsed muutused on substraadi hüdroksüülrühma ja raua kõrge spin-vormi vastasmõju tulemus. I tüüpi substraatide interaktsiooni kiirus P450-ga on reeglina suurusjärgu võrra kõrgem kui II tüüpi substraatide oma. Monooksügenaasi tsükli 2. etapis väheneb P450-substraadi kompleks. Tsütokroom P450 taastamiseks vajalik elektron pärineb NADPH-spetsiifilisest flavoproteiinist. Järgmine samm on hapniku aktiveerimine. Neid etappe iseloomustab oksü- ja peroksükomplekside P450 järjestikune moodustumine. P450 oksükompleks on võimeline dissotsieeruma superoksiidradikaalide vabanemisega, millest dismutatsioonireaktsioonis (tsükkel b) tekib vesinikperoksiid. Hapnikukompleksi redutseerimine teise elektroni poolt viib kahe elektroni redutseeritud peroksükompleksi moodustumiseni. Arvatakse, et see etapp on monooksügenaasi tsüklis piirav etapp. Peroksükompleksi lagunemisel tekib vesinikperoksiid (tsükkel c) ja moodustub reaktiivne oksenoidosake (FeO), mis sisaldab kuueelektronilist hapnikuaatomit, mis on liganditud raudraudaga. Selle osakese hapnikuaatomi saab üle kanda substraadi C-H sidemesse ja sinna viia. Teine välja pakutud mehhanism on heemi raua külge liganditud distaalse hapnikuaatomi atsüülimise võimalus. Selle kompleksi lagunemine viib perhappe moodustumiseni P450 aktiivses kohas. Perhappe madal reaktsioonivõime nõuab substraadi molekuli täiendavat aktiveerimist. Oksenoidi kaheelektroniline redutseerimine viib hapniku molekulist vee moodustumiseni (tsükkel d). Tõenäoliselt puudub tsütokroom P450 poolt katalüüsitavate reaktsioonide jaoks ühtne mehhanism.

Praeguseks on tuvastatud enam kui 160 erinevat P450 kodeerivat geeni. Teave primaarstruktuuri, substraadi spetsiifilisuse, indutseeritavuse, lokaliseerumise rakus, geenistruktuuri ja paljude muude omaduste kohta on toodud Venemaa Meditsiiniteaduste Akadeemia Biomeditsiinilise Keemia Instituudis loodud arvutiandmebaasis Cytochrome P450 (CPD). .

Molek. erinevate P450-de mass jääb vahemikku 44–60 kDa. Hemoproteiini monomeerid koosnevad ühest polüpeptiidahelast, mis sisaldab 45–55% mittepolaarseid aminohappejääke. Pesuaine puudumisel eksisteerib tsütokroom molekulidega agregaatide kujul. kaaluga 300–700 kDa. Täielik aminohappejärjestus on kindlaks tehtud enam kui 150 tsütokroom P450 jaoks. Kõige paremini uuritud on CYP2B4 ja CYP1A2, mis on eraldatud küüliku maksa mikrosoomidest pärast induktsiooni vastavalt fenobarbitaali ja 3-metüülkolantreeniga. CYP2B4 molekul koosneb 491 aminohappejäägistb ja CYP1A2 koosneb 516 aminohappejäägist. D. Ozols jt 1981. aastal ja O. Goto jt 1983. aastal leidsid CYP2 ja CYP1 perekondade hemoproteiinide primaarstruktuuri võrdlemisel 2 konservatiivset piirkonda

Tsütokroomid P 450 (EC 1. 14. 1) on heemi sisaldavate monooksügenaaside perekond, mis metaboliseerib ksenobiootikume, sealhulgas ravimeid. Lokaliseeritud raku sujuvas endoplasmaatilises retikulumis, mille avastasid D. Garfinkel, M. Klingenberg, 1958.

Tsütokroom P 450 (ing. Cytochrome P 450, CYP) Nimetus näitab, et see on värviline (P – inglise keelest pigment). Tsütokroom P 450, mis on seotud süsinikmonooksiidiga, omab maksimaalset valguse neeldumist lainepikkusel 450 nm, mis määras selle nime (T. Omura ja R. Sato 1964. aastal). CO-l pole P 450 funktsiooniga midagi pistmist. See lisatakse selleks, et hõlbustada P 450 sisalduse määramist neeldumisspektri intensiivsuse põhjal.

Mõiste "tsütokroom" kasutamist seoses P 450 klassi hemoproteiinidega ei saa pidada edukaks, kuna tsütokroomide funktsioon on elektronide ülekandmine, mitte monooksügenaasi reaktsioonide katalüüs. Tsütokroom P-450 kuulub b-tüüpi tsütokroomide hulka. Heemi eelkäija on protoporfüriin IX.

Erinevate tsütorakkude molekulmass. P 450 kõigub 44 - 60 k. Jah. Hemoproteiini monomeerid koosnevad ühest polüpeptiidahelast, mis sisaldab 45–55% mittepolaarseid aminohappejääke. Täielik aminohappejärjestus on kindlaks tehtud enam kui 150 tsüt. P 450. Röntgenkristallograafia abil uuriti Cyt. P. putida P 450. Valk sisaldab 414 aminohappejääki, M. m. - 47 k. Jah, see on asümmeetriline prisma, mille alus on 3,0 nm ja küljed on 5,5 ja 6,0 nm.

Cit. P. putida P 450 sisaldab 4 antiparalleelset spiraalset piirkonda, segu heeliksitest ja korrapäratutest struktuuridest, mis on segatud paralleelsete beetastruktuuridega. Heem paikneb kahe paralleelse spiraali vahel. Jäägid Arg-112, Arg-229 ja His-335 interakteeruvad heemi propioonrühmadega. Teised heemi ümbritsevad aminohapped on mittepolaarsed. Heem ei tule molekuli pinnale. Lühim kaugus pinnast heemini on umbes 0,8 nm.

Kõigil peptiidahela N-otsa fragmendi membraani tsütokroomidel P 450 on lühike hüdrofoobne piirkond, mis sisaldab 12 kuni 21 aminohappejääki. See toimib ankurpeptiidina ja sisaldab signaaljärjestust, mis vastutab valgu membraani viimise eest. Sellele järgneb stoppsignaali järjestus, mis peatab peptiidi inkorporeerimise fosfolipiidide kaksikkihti.

Tsütokroomid P 450 puuduvad ainult kohustuslikes anaeroobsetes organismides. Vähemalt 11 500 kirjeldatud? Cyt süsteemi valgud. P 450 bakterid ja arheed lahustuvad tsütoplasmas. Üleminek eukarüootsetele süsteemidele kaasnes P 450 inkorporeerimisega membraani. Kõik tsit. P 450 kõrgemad organismid – membraaniensüümid. Evolutsioonilises mõttes on kõige vanem bakteriaalne monooksügenaas.

Tsiteerimise süsteem. P 450 osaleb paljude, nii endogeensete kui ka eksogeensete ühendite oksüdatsioonis. Cit. P450-sõltuvad monooksügenaasid katalüüsivad elektronidoonori ja molekulaarse hapniku osalusel erinevate ainete lagunemist. Selles reaktsioonis kinnitub üks hapnikuaatom substraadile ja teine ​​redutseeritakse veeks. Hapniku sidumiskeskus on väga spetsiifiline, muundatud substraadi sidumiskeskus on suhteliselt.

Tsütokroom P 450 perekonna ensüümid on mitmekesised ja erinevad funktsioonide, ensümaatilise aktiivsuse tüüpide, aktiivsuse regulaatorite (inhibiitorid, indutseerijad) poolest. Üksikud isovormid (isoensüümid) tsit. P-450-d eristavad teatud spetsiifilisus ja igaüks neist osaleb suhteliselt väikese hulga ainete metabolismis.

Tsütokroom P 450 võib koos monooksügenaasi aktiivsusega avaldada oksüdaasi aktiivsust (A. I. Archakov et al.), st katalüüsida vesiniku eemaldamist substraadist, kasutades vesiniku aktseptorina hapnikku ja redutseerida seda veeks või tekitada hapniku aktiivseid vorme superoksiidi ja hüdroksüülradikaalide vorm, vesinikperoksiid. P 450 tuvastab peroksidaasi aktiivsuse, kasutades oksüdatsioonireaktsioonides kosubstraatidena NADPH asemel orgaanilisi peroksiide või vesinikperoksiidi. On tõendeid, et P 450 võib katalüüsida dioksügenaasi reaktsioone, viia oksüdeeritud ainesse kaks hapnikuaatomit. Seega on P 450 iseloomulikuks tunnuseks funktsioonide paljusus, kuid peamine on monooksügenaas.

Cit. P-450 kodeerib geenide superperekond. Inimestel süsteemis cit. P-450 paljastas 57 geeni ja üle 59 pseudogeeni (struktuurgeenide mittefunktsionaalsed analoogid, mis on kaotanud võime kodeerida valku ja ei ekspresseeru rakus. Mõiste "pseudogeen" pakuti esmakordselt välja 1977. aastal.). Nebert (1987) töötas välja tsitaatide klassifikatsiooni. P-450 põhineb lahkneval evolutsioonil ja nukleotiid/aminohappejärjestuse homoloogial. Ülemperekond jaguneb 18 perekonnaks ja 43 alamperekonnaks. Geenide nomenklatuur tsit. P-450 inimest kirjeldatakse üksikasjalikult.

Praegu on tuhanded isovormid (isoensüümid) cyt. R-450. Isovormid, milles on üle 40% aminohapete kogukoostisest, rühmitatakse perekondadesse ja tähistatakse araabia numbritega (CYP 1, CYP 2, CYP 3 jne). Alamperekonnad on tähistatud ladina tähtedega ja ühendavad isovorme, mille aminohappelise koostise identsus on üle 55% (CYP 2 D, CYP 3 A jne). Alamperekonnas tähistatakse üksikuid isovorme ladina tähtedele järgnevate araabia numbritega (CYP 1). A 2, CYP 2 D 6, CYP 3 A 4). Ksenobiootikum võib olla kahe või enama isovormi substraadiks. Erinevad isovormid on võimelised metaboliseerima sama ainet selle molekuli erinevates osades

Cit. P 450 katalüüsib küllastunud rasvhapete (l. kuni.) ω-oksüdatsiooni, küllastumata rasvhapete peroksüdatsiooni. to., steroidhormoonide, sapphapete ja kolesterooli hüdroksüülimine, prostaglandiinide biosüntees (lokaliseerub mitokondrites, tuumamembraanil). Tsütokroomid P 450 mikrosoomid osalevad ksenobiootikumide (ravimid, mürgid, narkootilised ained) metaboolses biotransformatsioonis. Ravimite metabolismis osalevad I, II ja III perekondade isovormid, millest peamised on IA 1, 1 A 2, 2 A 6, 2 B 6, 2 D 6, 2 C 9, 2 C 19, 2 E 1 , ZA 4 .

Üldinduktorid Ensüümid Fenobarbiidi induktor Raskmetallid l Tsütokroom P 450 süsteem Induktor Vähivastased ravimid Metüülkolantreen Tsütokroom P 448 süsteem Epoksiidhüdrolaasid Glutatioon ja UDPglükuronüültransferaasid GSH süntees Metallotioneiinid P-induktor

Fenobarbitaal aktiveerib tsüto sünteesi. P 450, UDP-glükuronüültransferaas ja epoksiidi hüdrolaas. Näiteks loomadel, kellele süstiti induktorfenobarbitaali, suureneb ER-i membraanide pindala, mis ulatub 90% -ni raku kõigist membraanistruktuuridest, ja selle tulemusena suureneb rakus osalevate ensüümide arv. ksenobiootikumide või endogeense päritoluga toksiliste ainete neutraliseerimine. Fenobarbitaali ja teatud tsüto osalusel metaboliseeruvate ravimite samaaegne kasutamine. P 450 viib viimaste efektiivsuse vähenemiseni, mis on tingitud molekuli muundumisest biotransformatsiooni protsessis või nende kiirest eemaldamisest kehast.

Praegu on kirjeldatud enam kui 250 keemilist ühendit, mis põhjustavad mikrosomaalsete ensüümide indutseerimist. Monooksügenaasisüsteemide indutseerijad jagunevad kahte klassi. Esimese klassi esindajad (insektitsiidid, etanool jne) põhjustavad hepatotsüütides sileda endoplasmaatilise retikulumi väljendunud vohamist ja tsütokroom P 450 aktiivsuse suurenemist.püreeniga jne ei kaasne sileda endoplasmaatilise retikulumi vohamine, vaid kl. samal ajal suureneb oluliselt paljude biotransformatsiooni ensüümide aktiivsus.Enamike ksenobiootikumide metabolismi kiirenemine toob kaasa toksilisuse vähenemise.Samal ajal suureneb oluliselt ka mõne ksenobiootikumi toksilisus induktiivpoolide mõjul.Näiteks süsiniku toksilisus tetrakloriid, bromobenseen, sinepigaas jne.

On kemikaale, mis on võimelised inhibeerima nii biotransformatsiooni 1. faasi (tsütokroom P-450 isoensüümid) kui ka biotransformatsiooni 2. faasi ensüüme (N-atsetüültransferaas jne) ning 3. faasi transportereid (RATPaas). Metaboolsete ensüümide aktiivsuse vähenemisega on võimalik nende ühendite pikaajalise vereringega organismis seotud kõrvaltoimete teke. Transporterite inhibeerimine ja ka nende esilekutsumine võib sõltuvalt selle transporteri funktsioonidest põhjustada mitmesuguseid muutusi (peamiselt suurenemist) ksenobiootikumide kontsentratsioonis vereplasmas.

EPR elektronide transpordiahelad 1 ahel sisaldab: 1) tsütokroom P 450, sellel on O 2 sidumiskeskused ja hüdrofoobne substraat; 2) NADPH-tsütokroom P 450 reduktaasi, mis sisaldab koensüüme FAD ja FMN; 3) NADPH+H+ on selles elektronide transpordiahelas ē ja H+ doonor; 4) O 2. 2 ahel sisaldab: 1) tsütokroom P 450; 2) ensüüm NADH-tsütokroom b 5 reduktaas, mille koensüümiks on FAD; 3) tsütokroom b 5 on hemoproteiin, mis kannab ē NADH-tsütokroom b 5 reduktaasilt tsütokroom P 450-le; 4) NADH + H+ on ē ja H+ doonor; 5) O 2. Tsütokroom P 450 sisaldab substraadi molekulis ühte O 2 aatomit ja 2. aatom taastub koos H 2 O moodustumisega ē ja H + ülekandumise tõttu NADPH + H +-st tsütokroom P osalusel. 450 reduktaasi (või NADH + H+ abil, kasutades tsütokroom b 5 reduktaasi ja tsütokroom b 5).

Teine EPR elektronide transpordiahela korraldusskeem.Ahela elektronide ja prootonite allikaks on NADPH + H +, mis tekib glükoosi oksüdatsiooni pentoosfosfaadi raja reaktsioonides. H+ ja e- vaheaktseptor on flavoproteiin, mis sisaldab koensüümi FAD (tsütokroom P 450 reduktaas). Mikrosomaalse oksüdatsiooniahela viimane lüli on tsütokroom P 450, mis redutseerib hapniku veeks. Süsteemi töö tsit. P-450 on seotud süsteemi toimimisega cit. b-5, mille elektronide ja prootonite allikas on NADH + H +, mis moodustub glükolüüsi käigus. H+ ja e- vaheaktseptor on flavoproteiin, mis sisaldab koensüümi FAD (tsütokroom b-5 reduktaas).

Näide RH - substraat tsüt. R-450; nooled näitavad elektronide ülekande reaktsioone. Taastatud vorm cit. -b5 oksüdeerib stearoüül-Co. A-monooksügenaas, mis kannab elektronid üle O₂. Üks O₂ aatom võtab 2 e¯ ja läheb kujule O²¯. Elektronide doonor on NADPH, mida oksüdeerib NADPH-cyt. P-450 reduktaas. О²¯ interakteerub prootonitega, moodustades voa: О²¯ + 2 Н⁺ → Н₂О Hapniku teine ​​toiming sisaldub substraadis RH, moodustades aine R-OH hüdroksüülrühma.

NADP-N-tsütokroom P-450 reduktaas on flavoproteiin. Üks mool ensüümi sisaldab ühte mooli flaviini mononukleotiidi (FMN) ja ühte mooli flaviinadeniindinukleotiidi (FAD). Kuna tsütokroom C võib toimida elektronide aktseptorina (kasutatakse mudelsüsteemides), nimetatakse seda ensüümi sageli NADP-tsütokroom reduktaasiks.

Substraadi hüdroksüülimise mehhanism tsütokroom P-450 osalusel Tavapäraselt võib eristada 5 etappi: 1. oksüdeeritud aine (S) moodustab kompleksi tsütokroom P-450 oksüdeeritud vormiga; 2. seda kompleksi redutseerib NADPH elektron; 3. redutseeritud kompleks ühineb O 2 molekuliga; 4. O 2 kompleksis lisab NADPH-le veel ühe elektroni; 5. kompleks laguneb koos H 2 O molekuli, tsütokroom P-450 oksüdeeritud vormi ja hüdroksüülitud substraadi (S-OH) moodustumisega.

Erinevalt mitokondriaalsest hingamisahelast ei salvesta monooksügenaasi ahel elektronide ülekande ajal energiat ATP kujul. Mikrosomaalne oksüdatsioon on vaba oksüdatsioon. Enamasti vähendab võõrainete hüdroksüülimine nende mürgisust. Siiski võivad tekkida tsütotoksiliste, mutageensete ja kantserogeensete omadustega tooted.

Tsütokroomid P-450 on membraanivalgud ja nende katalüütilise aktiivsuse uurimine nõuab monooksügenaasi süsteemi kompleksset rekonstrueerimist, kasutades redokspartnereid ja fosfolipiide. Lisaks on isoensüümid cyt. P-450 inaktiveeritakse kiiresti. Elektrokeemiline analüüsimeetod on oluliselt lihtsustanud tsütoaktiivsuse määramist. R-450. Esimesed tööd olid pühendatud elektroodi kasutamisele elektronide doonorina tsütokatalüüsi jaoks. P-450 (CYP 3 A 4): Kuznetsov B. A., Mestechkina N. M., Izotov M. V., Karuzina I. I., Karyakin A. V., Archakov A. I. (1979) Biochemistry, 44, 1569-1574. Archakov A. I., Kuznetsov B. A., Izotov M. V., Karuzina I. I. (1981) Biophysics, 26, 352-354.

Praeguseks on välja töötatud elektroodile immobiliseeritud tsütokroomidel P-450 põhinevad elektrokeemilised biosensorsüsteemid. Elektrokatalüütilise reaktsiooni käivitavad elektroodilt tulevad elektronid. See välistab vajaduse kasutada monooksügenaasi süsteemi redokspartnereid ja NADPH redutseerivaid ekvivalente. Immobiliseeritud tsüto katalüütilise aktiivsuse määramine. P-450 viiakse läbi katalüütilise voolu registreerimisega, mis tekib substraadi sisestamisel elektrokeemilisse süsteemi. Katalüütilise voolu registreerimine toimub voltammeetria või amperomeetria meetoditega ja see võimaldab teil arvutada ensümaatilise protsessi paljusid omadusi: Michaelis-Menteni konstant, elektrokeemiline katalüütiline konstant.

Katalüütilise voolu muutuse sõltuvus ampermeetrilise tiitrimise ajal tsit. P-450 3 A 4 (CYP 3 A 4) testosteroon kontrollitud pingel E = -0,5 V (vs. Ag/Ag. Cl). Sisend näitab elektrokeemilise KM [testosterooni] arvutamist. (V. V. Shumyantseva et al., 2015)

Elektrokeemilistel tsütokroom P 450 sisaldavatel süsteemidel põhinevate biosensorite väljatöötamine võimaldab tuvastada substraate (ksenobiootikume), uurida ravimite mõju spetsiifiliste tsütokroom P 450 isovormide katalüütilisele aktiivsusele Preparaadid CYP aktiivsuse jaoks elektroodis/tsütokroom P 450 süsteemid.

Elektrokeemilise meetodi eelised tsütokroom P 450 monooksügenaasi süsteemi uurimisel 1) elektrokeemiline süsteem ei nõua NADPH ja NADH kallite ja ebastabiilsete redutseerivate ekvivalentide kasutamist, kuna kasutatakse alternatiivset elektronide allikat - elektroodi; 2) ei nõua monooksügenaasi süsteemi täielikku rekonstrueerimist (kõigi mikrosomaalse süsteemi komponentide ja tsütokroom P 450 katalüütilise tsükli redokspartnerite valkude kasutamine); 3) meetod on ülitundlik ja võimaldab kasutada minimaalses koguses kallist ensüümi (kuni 10-12 µmol valku/elektroodi); 4) ensümaatilise protsessi elektrokatalüüs ja juhitavus elektrivoolu abil on kõrge efektiivsusega; 5) intaktsete P 450 isovormide inaktiveerimist saab ära hoida erinevate sünteetiliste elektroodide pinna modifikaatorite kasutamisega.

Ksenobiootilise biotransformatsioonisüsteemi seisundi hindamise meetodid: 1) Kõrgefektiivne vedelikkromatograafia (HPLC). See võimaldab pärast ksenobiootikumi (ravimi) manustamist uurida analüüte uriinis, veres, süljes ja muus bioloogilises materjalis. Testitava ravimi poolväärtusaja, näiva jaotusmahu, eliminatsiooni kliirensi ja muude parameetrite määramiseks saab teha kineetilist analüüsi. Analüüt on mõõdetava proovi komponent või omadus. See mõiste hõlmab mis tahes elementi: ioon, ühend, aine, faktor, nakkustekitaja, rakk, organellid, aktiivsus (ensümaatiline, hormonaalne, immunoloogiline) või märk: olemasolu või puudumine, kontsentratsioon, aktiivsus, intensiivsus või muud omadused, mis tuleb määrata. Kontseptsiooni sõnastas USA riiklik kliiniliste laboratoorsete standardite komitee (NCCLS, dokument NRSCL 8 -A). Lähedaselt mõistele kasutame "laboriindikaator", "parameeter", "test" jne.

2) tsütgeenide polümorfismi ja mutantsete vormide PCR-RFLP analüüs. R-450. W; CYP 1 A 2 geeni restriktsioonifragmendi pikkuse polümorfismi analüüsi (RFLP analüüs) tulemused: 1, molekulmassi marker; 2, 4, 6, 7, 8, 10 ja 11 - mutantne genotüüp - M (mutatsioon restriktsioonikohas - restriktsiooni ei esine); 3 - mutatsioon puudub - metsiktüüpi genotüüp - 5 ja 9 - heterosügootne genotüüp - kõik fragmendid on olemas - H; 12 - negatiivne kontroll.

3) DNA-kiibid Võimaldavad üheaegselt määrata ühes proovis väga suure hulga polümorfisme. Väga väikesele tahkele kiibile asetatakse suur hulk oligonukleotiidsonde eraldi täppide kujul, millest igaüks tagab spetsiifilise hübridisatsiooni paljude erinevate geenide normaalsete ja mutantsete alleelidega. Enne hübridiseerimist tehakse uuritava DNA mittespetsiifiline fluorestsentsmärgistamine. Kui proovi DNA seostub kiibil oleva sondiga, tuvastatakse kiibi vastava lõigu fluorestsentssignaal [Ivanov, Tereshin, Shcherbak, 2010]. Teades, milline alleel vastutab ühe või teise tsütoisoensüümi sünteesi eest. P-450 abil on võimalik kindlaks teha, millised ksenobiootikumid biotransformeeritakse ja mil viisil.

4) Arvutiprogrammid ligandide interaktsiooni modelleerimiseks tsütokroomidega P 450 Substraadi ja ensüümi interaktsiooni uurimiseks kasutatakse molekulaarse dokkimise ja molekulaarse dünaamika meetodeid. Molekulaarne dokkimine (ehk molekulaarne dokkimine) on molekulaarse modelleerimise meetod, mis võimaldab ennustada ühe molekuli kõige soodsamat orientatsiooni ja asendit teise suhtes stabiilse kompleksi moodustamiseks. Skoorimisfunktsioonide (inglise skoori - skoor) abil määratakse ligandi energeetiliselt soodsaimad konformatsioonid aktiivses keskuses. Molekulaardünaamika on meetod, mille käigus jälgitakse interakteeruvate aatomite või osakeste süsteemi ajalist arengut, integreerides nende liikumisvõrrandid. See mängib olulist rolli (koos kristallograafia ja NMR-ga) valgu struktuuri määramisel ja selle omaduste selgitamisel. Kõige populaarsemad tarkvarapaketid bioloogiliste molekulide dünaamika modelleerimiseks on: AMBER, CHARMM (ja kaubanduslik versioon CHARMMm), GROMACS, GROMOS, Lammhs, HOOMD-blue, NAMD.

Interaktsiooni kirjeldamisel tsit. P-450 ja ligandide puhul hinnatakse ruumiliste ja energiafaktorite rolli, kuna nende tegurite panust erinevatesse tsütorakkudesse. R 450 on erinev. Madala molekulmassiga ligandi ja Cyt vahelise interaktsiooni ammendavaks kirjelduseks. P-450 in silico ja võimalike biotransformatsioonide prognoosimisel on vaja arvestada: § ensüümi reaktsioonivõimet, § ensüümi aktiivse saidi struktuuri, § ligandi paiknemist ja konformatsiooni aktiivses kohas. ensüümi, § võimalus siduda substraati ensüümi aktiivses kohas mitmel viisil (seondumine võib toimuda kaudselt läbi vee molekulide), § substraadile omane regiospetsiifiline reaktiivsus (see võib varieeruda sõltuvalt konformatsioonist, mille substraat), § toote afiinsus ensüümi aktiivsest saidist vabanemiseks.

R-tion naz. regiospetsiifilised, kui üksustena. saadus (vea piires), moodustub üks kahest või enamast võimalikust regioisomeerist. Regioisomeerid on isomeerid, mis tekivad ühe substraadi molekulis esineva mitme võimaliku reaktsioonitsentri transformatsioonist. Kui p-tooni produktides domineerib ainult üks isomeer, nimetatakse sellist p-tooni. regioselektiivne. Nt. , toimub ebasümmeetrilise elektrofiilse HBr lisamine ebasümmeetrilisele stüreenile C 6 H 5 CH=CH 2 regiospetsiifiliselt: moodustub ainult üks kahest võimalikust liitproduktist C 6 H 5 CHBr. CH3, kuid mitte C6H5CH2Br.

QSAR mudelid. Kvantitatiivsed struktuuri-aktiivsuse seosed (QSAR - lühend sõnast Quantitative Structure-Activity Relationships) võimaldavad ennustada nende omadusi keemiliste ühendite struktuuri kirjelduse põhjal, sealhulgas määrata interaktsiooni madalmolekulaarsete ühendite tsütokroomidega ja nende biotransformatsiooni. Näiteks: 1) erinevate tsütokroomide substraatide klassifitseerimiseks kasutatakse: tugivektorite konstrueerimise meetodit, K-lähimate naabrite meetodit, otsustuspuu meetodit jne -D QSAR) meetodeid.

Superfamily tsit. P-450 katalüüsib suurt hulka erinevate mehhanismide kaudu kulgevaid reaktsioone, mistõttu ei saa klassikalisi QSAR-meetodeid õigesti rakendada erinevatesse klassidesse kuuluvate ainete puhul. Iga üksiku ksenobiootilist ainet metaboliseeriva tsütokroomi jaoks tuleb luua spetsiaalne QSAR-mudel, kasutades erinevaid deskriptoreid ja erinevaid matemaatilisi meetodeid.

Peamised in silico uuritud tsütokroomid P 450, mis vastutavad ravimite metabolismi eest inimkehas, on tsütokroomide alamperekond. P-450 3 A. Tsütokroom P 450 3A 4 on membraaniga seotud valk, mis asub endoplasmaatilises retikulumis. Molekulmass on 57299 D, primaarstruktuur sisaldab 502 aminohappejääki. CYP 3 A 4 geen asub seitsmenda kromosoomi pikal käel (7 q 22,1). 3A alamperekond avaldub kõige enam maksas ja soolestikus. Ligikaudu 2/3 maksa tsütokroomidest kuulub sellesse alamperekonda. Kaks tsit. P 450 FOR 4 ja 3 A 5 on kirjanduses üksikasjalikult kirjeldatud. Cit. Erinevalt FOR 4-st on P 450 FOR 5 tavalisem noorukitel, polümorfselt ekspresseeritud ja glükokortikoidide poolt indutseerimata. On veel üks embrüonaalselt ekspresseeritud isovorm – FOR 7 (moodustab 50% loote tsütokroomidest P 450).

Tsütokroom b 5 on hemoproteiin, mis osaleb elektroni kandjana erinevates biokeemilistes redoksreaktsioonides. Mikrosomaalse tsütokroom b 5 molekul koosneb kahest domeenist - hüdrofiilsest ja hüdrofoobsest. Hüdrofiilne N-terminaalne piirkond asub ER-i membraani pinnal, on moodustatud aminohappejääkidest vahemikus 1-88 ja sisaldab heemi, mis on osa aktiivsest keskusest. Tsütokroom b 5 molekuli asukoha skemaatiline kujutis membraanis.

Tsütokroom b 5 hüdrofoobne domeen on ankurdatud lipiidide kaksikkihti (EPR või mitokondriaalne), spiraalitud, moodustatud valgumolekuli C-otsa aminohappejääkidest (aminohappejäägid 89-133). Arvutisimulatsiooni abil näidati, et tsütokroom b 5 molekuli C-terminaalne piirkond moodustab silmuse ja tungib läbi lipiidmembraani. Suurimat hüdrofoobsust täheldatakse membraani sukeldatud silmuse keskmises osas. Ensüümmolekuli C-otsa osa mängib olulist rolli membraani integreerumisel, ensüümi orientatsioonil lipiidide kaksikkihis ja funktsionaalse aktiivsuse tagamisel.

Mitokondrite välismembraani tsütokroom b 5 on võrreldes mikrosomaalsega väiksema redokspotentsiaaliga, molekul on keemilise ja termilise denaturatsiooni suhtes vastupidavam, side apoproteiini ja heemi vahel on palju tugevam. Mitokondrite tsütokroom b 5 molekulis avastati kaks hüdrofoobset piirkonda. Esimese moodustavad alaniin-18, isoleutsiin-32, leutsiin-36 ja leutsiin-47 jäägid. Teine on isoleutsiin 25, fenüülalaniin-58, leutsiin-71 ja heem. Kasutades molekuli mutantseid vorme, näidati, et mõlemal hüdrofoobsel piirkonnal on suur tähtsus molekuli stabiilsuse säilitamisel. Aminohappejääkide puudumisel või asendamisel neis väheneb apoproteiini interaktsioon heemiga.

Tsütokroom b 5 roll reaktsioonides, mida katalüüsivad tsütokroom P-450 süsteemi isovormid. Stimuleeriva toime võimalikud mehhanismid op. b5 isovormidel cyt. P-450: otsene elektronide ülekanne monooksügenaasi reaktsioonis, ilma NADP tsütokroom P-450 reduktaasi vahendamiseta; tsütokroom b 5 teise elektroni kasutamisel monooksügenaasi tsüklis toimub aktiivsemate hapnikuradikaalide moodustumine, millega omakorda kaasneb metaboliidi kiirem moodustumine;

tsit. b 5 suhtleb tsit. P-450 kahe hemoproteiini kompleksi moodustumisega ja sellele järgneva kahe elektroni ülekandega NADPH tsütokroom P-450 reduktaasist. See suurendab aktiivse hapniku moodustumise kiirust ja välistab vajaduse cyt korduva interaktsiooni järele. P-450 ja NADPH tsütokroom P-450 reduktaas; tsit. b5 võib läbi viia tsüto allosteerilist stimulatsiooni. P-450 ilma elektronide ülekandeta, näiteks katalüütilise tsükli teises etapis; tsütokroom b5 võib avaldada kaitsvat toimet terminaalse oksügenaasi molekulidele, mis ei ole seotud redokstsükli reaktsioonidega, mis takistab selle hävitamist.

Mõju tsit. b 5 reaktsioonikiiruse muutumise, metaboliitide spektri ja reaktiivsete hapnikuliikide moodustumise kohta süsteemi reaktsioonides cit. R-450. tsit juuresolekul. b 5 enamiku endogeensete ühendite ja ksenobiootikumide ainevahetuse kiirus on kõige sagedamini suurenenud; mõju tsit. b 5 sama ühendi, näiteks androsteendiooni, biotransformatsiooni kohta ei ole erinevatel loomaliikidel sama. Küülikutel cyt b 5 juuresolekul steroidide metabolismi kiirus cyt. P-450 2 B 5 suureneb ja koertel - tsüt. Р-450 2 В 11 väheneb;

tsit. b 5 erinevatel liikidel (inimene ja hamster) ei pruugi muuta ühendi (nitrosamiini) oksüdatsioonikiirust ega omada stimuleerivat toimet; tsit olemasolu. b 5 muudab metaboliitide spektrit, mis moodustuvad ühendi biotransformatsioonil sama tsütoisovormi poolt. P-450, näiteks tetraklorobifenüültsüt. R-450 2 in 1; tsit juuresolekul. b 5 väheneb reaktiivsete hapnikuühendite teke, mille ületootmine avaldab negatiivset mõju keharakkude elutegevusele; bioloogiliselt aktiivsete ühendite (arahhidoonhape, leukotrieenid) metabolism toimub ainult tsüto juuresolekul. b 5.

Tsütokroom b 5 mõju reaktsioonikiiruse muutumisele, metaboliitide spektrile ja reaktiivsete hapnikuliikide moodustumisele reaktsioonides, mis hõlmavad erinevaid tsütokroomi isovorme. P-450 (fragment) Tsütokroom P-450 isovorm Substraat Reaktsioonikiiruse muutus P-450 1 A 1 tetraklorobifenüül P P-450 2 A 1 P-450 2 B 1 Androsteenedioon P - II - P P-450 2 B 2 2 - kloor -1,1 difluoroetiin tetraklorobifenüül (2, 2", 5, 5"- ja 2, 3", 4", 5 -) tetraklorobifenüül (2, 3, 4, 4 -) 9-antraldehüüd Р-450 2 В 4 Tetranitrometaan H - II - Aminopüriin P Androsteendioon P Testosteroon ei muutu Reaktiivsete hapnikuliikide moodustumine ↓ metanool, 7-etoksükumariin 9 -antraldehüüd Metaboliitide spektri muutus P-450 1 A 2 - II - P-450 2 B 5 - II - ↓ P P muutub ↓ muudab P muutub

NADH-tsütokroom b5-reduktaas on flavoproteiin. See on kahedomeeniline valk, globulaarne tsütosoolne domeen seob FAD-i, hüdrofoobne domeen (ainus "saba") kinnitab valgu membraani.

Tsütokroom P450(CYP450) on suur rühm ensüüme, mis vastutavad võõrkehade orgaaniliste ühendite ja ravimite metabolismi eest. Tsütokroom P450 perekonna ensüümid viivad läbi ravimite ja paljude teiste endogeensete bioorgaaniliste ainete oksüdatiivset biotransformatsiooni ning täidavad seega detoksifitseerimisfunktsiooni. Tsütokroomid osalevad paljude ravimite klasside, nagu antihistamiinikumid, retroviiruse proteaasi inhibiitorid, bensodiasepiinid, kaltsiumikanali blokaatorid jt, metabolismis.

Tsütokroom P450 on valgukompleks kovalentselt seotud heemiga (metallivalk), mis tagab hapniku lisamise. Heem on omakorda protoporfüriini IX ja kahevalentse rauaaatomi kompleks. Number 450 näitab, et vähendatud CO-ga seotud heemil on maksimaalne valguse neeldumine lainepikkusel 450 nm.

Tsütokroomid P-450 osalevad mitte ainult ravimite metabolismis, vaid ka hemoglobiini muundamises bilirubiiniks, steroidide sünteesis jne. Kõik tsütokroom P-450 isovormid on rühmitatud CYP1, CYP2, CYP3 perekondadesse. Perekondade sees eristatakse alamperekondi A, B, C, D, E. Alamperekondade sees tähistatakse isovorme järjekorranumbriga. Näiteks CYP2C19 on alamperekonna "C" perekonna "2" 19. tsütokroomi nimi. Kokku on umbes 250 erinevat tüüpi tsütokroom P-450, millest ligikaudu 50 on inimkehas ja ainult kuus neist (CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP3A4) on seotud ravimite metabolismiga.

Tsütokroomide P-450 aktiivsust mõjutavad paljud tegurid – suitsetamine, alkohol, vanus, geneetika, toitumine, haigused. Need tegurid vastutavad P-450 ensüümide töö individuaalsete omaduste kujunemise eest ja määravad kindlaks ravimite koostoimete mõju konkreetsele patsiendile.

Tsütokroomide P450 tähtsus gastroenteroloogia jaoks

Gastroenteroloogide hiljutine märkimisväärselt suurenenud huvi tsütokroom P450 isovormide CYP2C19 ja CYP3A4 vastu on tingitud nende rollist bensimidasooli derivaatide metabolismis, mis hõlmavad kõiki A02BC rühma "prootonpumba inhibiitorid" kuuluvaid ravimeid (, ja). Kliiniliselt on oluline, et CYP2C19 geen on polümorfne ja erinevate PPI-de terapeutilise toime ulatus sõltub suuresti selle geeni seisundist patsiendil.

PPI-de hulgas on CYP2C19-le suurim inhibeeriv toime lansoprasoolil ning vähemal määral omeprasoolil ja esomeprasoolil. Rabeprasooli toime on veelgi väiksem, kuid selle mitteensümaatilise metabolismi käigus tekkiv tioester pärsib oluliselt CYP2C19 aktiivsust. Pantoprasoolil on vähim mõju CYP2C19-le. Suurim CYP3A4 inhibeeriv toime in vitro on pantoprasoolil, millele järgneb (toime vähenemisel) omeprasool, esomeprasool ja rabeprasool ning lansoprasool. Mitut ravimit saavate patsientide puhul on eelistatud PPI () pantoprasool.

CYP3A4 aktiivsel osalemisel toimub metabolism ja suur hulk muid ravimeid.

Mitmed gastroenteroloogilised ravimid inhibeerivad tsütokroom CYP3A4, mõjutades seeläbi samaaegselt manustatavate ravimite farmakokineetikat.

Ravimite koostoime probleem

Kaasaegses kliinilises praktikas on ravimite kombineeritud kasutamine laialt levinud, mis on seotud mitmete haiguste esinemisega patsiendil või monoteraapia ebapiisava efektiivsusega. Kombineeritud ravi korral on ravimite koostoimed võimalikud. Rohkem kui ühte ravimit võtab ligikaudu 56% alla 65-aastastest patsientidest ja 73% üle 65-aastastest patsientidest. Kahe ravimi võtmine põhjustab nende koostoimet 6% patsientidest. 5 (või 10) ravimi väljakirjutamine suurendab koostoimete sagedust 50 (või 100)%ni.

Potentsiaalselt ohtlikud ravimite kombinatsioonid on tõsine kliiniline probleem. On tõendeid, et 17–23% arstide määratud ravimite kombinatsioonidest on potentsiaalselt ohtlikud. Ainuüksi USA-s sureb igal aastal 48 000 patsienti ravimite soovimatute koostoimete tõttu. tühistas mitu ravimit registreerimisest (kaasa arvatud) nende potentsiaalselt ohtlike koostoimete tõttu teiste ravimitega, sealhulgas surmaga lõppevate ravimitega.

Ravimite koostoimete peamised mehhanismid on seotud muutustega nende farmakokineetikas või farmakodünaamikas. Kaasaegsete kontseptsioonide kohaselt on kõige olulisemad muutused farmakokineetikas ravimite metabolismi ajal tsütokroomide P-450 osalusel.

Ohtliku koostoime näide on hiljuti avastatud PPI-de koostoime, mida kasutatakse laialdaselt südame isheemiatõvega patsientide ravis. Seedetrakti tüsistuste riski vähendamiseks määratakse patsientidele, kes saavad atsetüülsalitsüülhapet koos klopidogreeliga, PPI-d. Kuna klopidogreeli bioaktiveerimine toimub CYP2C19 osalusel, võib selle tsütokroomi poolt metaboliseeritavate PPI-de kasutamine vähendada klopidogreeli aktivatsiooni ja trombotsüütide agregatsioonivastast toimet. 2009. aasta mais esitati Kardiovaskulaarse Angiograafia ja Sekkumiste Ühingu (SCAI) konverentsil andmed, mis näitavad, et klopidogreeli ja PPI-de samaaegne kasutamine suurendab oluliselt müokardiinfarkti, insuldi, ebastabiilse stenokardia riski ning vajadust korduvate koronaarsete sekkumiste järele. ja koronaarsurm ().

Tsütokroom CYP2C19

Tsütokroom P450 isovorm CYP2C19 (S-mefenütoiini hüdroksülaas) katalüüsib püridiinitsükli 5-hüdroksüülimise ja bensimidasoolitsüklis 5"-demetüleerimise reaktsioone.Inimese kehas paikneb CYP2C19 hepatotsüütides.

Kõik mutatsioonid CYP2C19 geenis võib jagada kolme rühma:

1. Ilma mutatsioonideta (homosügootid) on nad ka kiired PPI metaboliseerijad.
2. Omades mutatsiooni ühes alleelis (heterosügootides), mis on ainevahetuse vahepealne tüüp.
3. Omades mutatsioone mõlemas alleelis, on nad ka aeglased PPI metaboliseerijad.

CYP2C19 genotüüpide levimus, metabolismi tüüp ja PPI-de mõju happega seotud haiguste ravis on toodud tabelis:

Aeglased metaboliseerijad erinevad kiiretest ja vahepealsetest metaboliseerijatest kaks korda kõrgema PPI-de kontsentratsiooni ja poolestusaja poolest vereplasmas. 2C19 isovormi kodeeriva geeni polümorfism määrab PPI metabolismi erineva kiiruse patsientidel. Seoses eelnevaga on soovitatav IPP valik läbi viia kontrolli all ().

• CYP2C19 metaboliseerib aktiivselt järgmisi ravimeid: tritsüklilised antidepressandid (amitriptüliin, klomipramiin, imipramiin), antidepressandid - selektiivne serotoniini tagasihaarde inhibiitor tsitalopraam, antidepressant - MAO inhibiitor moklobemiid, krambivastased ained ja epilepsiavastased ained (diasepaam, primidoon, fenütobarbi pumbataal). ja ), malaariavastane proguaniil ja indometatsiin, samuti: varfariin, gliklasiid, propranolool, tsüklofosfamiid, nelfinaviir, progesteroon, teniposiid, tetrahüdrokannabinool, karisoprodool, vorikonasool ja teised
• tugevad CYP2C19 inhibiitorid: moklobemiid, fluvoksamiin, klooramfenikool (levomütsetiin)
• CYP2C19 mittespetsiifilised inhibiitorid: PPI omeprasool ja lansoprasool, indometatsiin, samuti felbamaat, ketokonasool, modafiniil, okskarbasepiin, probenetsiid, tiklopidiin,
• CYP2C19 indutseerijad: rifampitsiin, artemisiniin, karbamasepiin, noretisteroon, prednisoon, naistepuna ürt.

Tsütokroom CYP3A4

CYP3A4 ensüüm katalüüsib sulfoksüdatsioonireaktsiooni, mis viib sulforühma moodustumiseni. CYP3A4 on ravimite jaoks üks olulisemaid tsütokroome, kuna see biotransformeerib vähemalt osaliselt umbes 60% oksüdeerunud ravimitest. Kuigi CYP3A4 aktiivsus on väga erinev, ei allu see geneetilisele polümorfismile. CYP3A4 paiknemine apikaalsetel membraanidel ja hepatotsüütidel hõlbustab selle ravimi metabolismi enne süsteemsesse vereringesse sisenemist, mida nimetatakse "esimese passi efektiks".

CYP3A4 geneetiline defekt võib võtmisel põhjustada sekundaarse pika QT-intervalli sündroomi ja selle tulemusena südame arütmia ().

• CYP3A4 on peamine ensüüm järgmiste ravimite metabolismis: immunosupressandid (tsüklosporiin, siroliimus, takroliimus), keemiaravi ained (anastrosool, tsüklofosfamiid, dotsetakseel, erlotiniib, tüfostiin, etoposiid, ifosfamiid, paklitakseel, blasti-vinnifiid, vinnibiini, ), seenevastased ained (klotrimasool, ketokonasool, itrakonasool), makroliidid (, erütromütsiin), tritsüklilised antidepressandid (amitriptüliin, klomipramiin, imipramiin), antidepressandid - selektiivsed serotoniini tagasihaarde inhibiitorid (tsitalopraam, estsitalopraam, antikoprassoliin), risperidoon), opioidanalgeetikumid (alfentaniil, kodeiin, metadoon, fentanüül), bensodiasepiinid (alprasolaam, klonasepaam, midasolaam, flunitrasepaam), lipiidide taset alandavad statiinid (atorvastatiin, lovastatiin, simvastatiin), kaltsiumikanali blokaatorid (amlodipiin, verazempaam

Tsütokroomid P450. Struktuur ja funktsioon

Esimese faasi ensüümide hulgas on tsütokroom P450 süsteem (P450 või CYP) katalüütilise aktiivsuse osas suure hulga ksenobiootikumide suhtes juhtival kohal. Tsütokroom P450 kõrgeim kontsentratsioon on leitud hepatotsüütide (mikrosoomide) endoplasmaatilises retikulumis. Maksa mikrosomaalsed tsütokroomid P450 mängivad olulist rolli võõrühendite toime intensiivsuse ja aja määramisel ning võtmerolli ksenobiootikumide detoksifitseerimisel, samuti nende aktiveerimisel toksilisteks ja/või kantserogeenseteks metaboliitideks. Tsütokroom P450-sõltuvad monooksügenaasid on multiensümaatiline elektronide transpordisüsteem. Kõik tsütokroomid P450 on heemi sisaldavad valgud. Heemraud on tavaliselt oksüdeeritud olekus (Fe3+). Fe2+ ​​olekusse taastudes on tsütokroom P450 võimeline siduma ligande nagu hapnik või süsinikmonooksiid. Redutseeritud tsütokroom P450 kompleksi koos COga neeldumismaksimum on 450 nm, mis oli aluseks

nende ensüümide nimed. Peamine tsütokroom P450 poolt katalüüsitav reaktsioon on monooksügenaas, milles üks hapnikuaatom interakteerub substraadiga (RH) ja teine ​​redutseeritakse H2O-ks. NADPH osaleb reaktsioonis redutseeriva ainena:

RH (substraat) + O2 + NADPH + H+ --> ROH (produkt) + H2O + NADP+

Mehhanism, mille abil tsütokroom NADPH-st elektroni vastu võtab, sõltub tsütokroom P450 rakusisesest lokaliseerimisest. ER-s, kus asub suurem osa ksenobiootikumide biotransformatsioonis osalevatest hemoproteiinidest, viiakse elektron üle flavoproteiini, mida nimetatakse NADPH-P450 reduktaasiks. Üks reduktaasi molekul võib edastada elektrone mitmele erinevale P450 molekulile. Mitokondrites, kus paiknevad itokroomid P450, mis osalevad steroidhormoonide biosünteesis ja D-vitamiini metabolismis, toimub elektronide ülekandmine 2 valgu abil: ferrodoksiini või ferrodoksiini reduktaasi.

Joonisel fig. 1 näitab tsütokroom P450 katalüütilist tsüklit. Tsükli esimene osa koosneb hapniku aktiveerimisest, teine ​​- substraadi oksüdatsioonist. Mikrosomaalse monooksügenaasi süsteemi toimeskeemi kirjeldasid esmakordselt Estabrook jt, nüüdseks on seda kinnitanud ka paljud teadlased. See skeem on järgmine: esimene etapp koosneb substraadi interaktsioonist P450 oksüdeeritud vormiga. Kui P450 seondub aluspindadega

toimub heemi raua üleminek madala spinni olekust kõrge spinni olekusse. Teine etapp seisneb saadud ensüümi-substraadi kompleksi redutseerimises esimese elektroniga, mis pärineb NADPH-spetsiifilisest ülekandeahelast NADPH-st läbi.

flavoproteiin I (NADPH-tsütokroom P450 reduktaas). Kolmas etapp seisneb kolmekordse kompleksi moodustamises: redutseeritud tsütokroom P450-substraat-hapnik. Neljas etapp

kujutab kolmekomponentse kompleksi taandamist teise elektroni võrra, mis nagu

arvatakse olevat pärit NADH-spetsiifilisest elektronide transpordiahelast, mis koosneb NADH-

tsütokroom b5 reduktaas ehk flavoproteiin II ja tsütokroom b5. Viies etapp koosneb mitmest protsessist, sealhulgas redutseeritud kolmekomponendilise kompleksi molekulisisesed muundumised ja selle lagunemine hüdroksüülitud produkti ja vee moodustumisega. Selles etapis läheb tsütokroom P450 algsesse oksüdeeritud vormi.

Tsütokroomid P450 katalüüsivad järgmist tüüpi reaktsioone: alifaatse või aromaatse süsinikuaatomi hüdroksüülimine; kaksiksidemega epoksüdatsioon;

aatomi oksüdatsioon (S, N, I) või N-hüdroksüülimine; oksüdeeritud rühma ülekandmine;

eetriühenduse hävimine; dehüdrogeenimine. Mõned reaktsioonid katalüüsiti

tsütokroom P450 on esitatud joonisel fig. 2 ja 3. Head on mitut tüüpi reaktiive

ahela viimane süsinik hüdroksüleeritakse, nn oomega-hüdroksüülimine. Niisiis

kuid mitmes asendis (positsioonid -1, -2) toimub sisemine hüdroksüülimine.

See toob kaasa palju erinevaid tootevalikuid, isegi lihtsa alkaani nagu heksaan puhul. Pange tähele, et tsüklilised süsivesinikud läbivad ka hüdroksüülimise. Hüdroksüülimisreaktsioonis moodustub esmalt poolatsetaal, mis seejärel muutub alkoholiks ja aldehüüdiks. Kui alkeenid oksüdeeritakse tsütokroom P450 toimel, tekivad kaheaatomilised oksiidid. Need erinevad oma stabiilsuse poolest ja võivad olla väga reaktsioonivõimelised. Näiteks vinüülkloriid muundatakse metaboolselt oksiidiks, mis seejärel kloroatsetaldehüüdiks, mutageeniks, mis toimib otse DNA-le. Nende uuringute tulemusel keelati vinüülkloriidi kasutamine pihustites. Sterooli vinüülrühm (vinüülbenseen) on tuntud oma kantserogeensete omaduste poolest, kuid inimkeha suudab selle neutraliseerida, muutes oksiidi ensüümi epoksühüdrolaasi abil diooliks. Kuid epoksühüdrolaas ei aita alati. Näiteks tsütokroom P450 sünteesib aflotoksiin B1 epoksiidi in vivo. See ühend on väga reaktiivne elektrofiil, ei ole stabiilne ja moodustab kiiresti adukti DNA-ga. Lisaks on epoksiidist moodustunud diool samuti ebastabiilne ja väga reaktsioonivõimeline. Aromaatsete ühendite oksüdeerimine tsütokroom P450-ga annab samuti epoksiide, kuid need muutuvad kiiresti fenooliks. Benseeni hüdroksüülimise tulemusena saab tekkinud fenooli uuesti hüdroksüülida, muutudes katehhooliks või hüdrokinooniks. Pange tähele, et katehhool ja hüdrokinoon võivad reageerida hapnikuga, pärssides sarnaseid reaktsioone kinoonide ja superoksiididega, mis on toksiinid. Selline tuntud ühend nagu 2,3,7,8-tetraklorodibenseendioksiin (TCDD) ei allu hüdroksüülimisele ja on stabiilne (poolestusaeg inimkehas on aasta või rohkem).