Western blotting është një metodë që përfshin kërkimin e antitrupave specifikë kundër baktereve, duke shkaktuar sëmundje Lyme. Çfarë është një test Western blot? Si të interpretohen rezultatet e studimit?

Western blottingështë një test që kërkon antitrupa që trupi prodhon kundër baktereve që shkaktojnë sëmundjen Lyme. Në sipërfaqen e baktereve ka antigjene, kundër të cilave trupi ka antitrupa specifikë në klasat IgM dhe IgG. IgM.

Imunoglobulina M (IgM) - prodhohet kur trupi ynë ndeshet për herë të parë me një patogjen të caktuar. Një rritje në sasinë e IgM kundër një patogjeni të caktuar tregon fillimin e procesit të sëmundjes.

Imunoglobulina G (IgG) prodhohet nga trupi pas IgM, më së shumti nivel të lartë arrihet rreth gjashtë muaj pas infektimit dhe ndryshe nga IgM antitrupat mund të qëndrojnë në gjak për një kohë shumë të gjatë, madje edhe disa vjet.

Testi Western Blot - indikacione për kryerjen

Western blot përdoret në fazën e dytë të diagnostikimit të borreliozës - kur testi ELISA (testi i parë) jep një rezultat pozitiv ose të paqartë. Megjithatë, nuk përdoret kur testi ELISA është qartësisht negativ.

Western blotting - cili është testi?

Testi Western Blot për borreliozën (sëmundja Lyme) vlerëson me saktësi antitrupat ndaj fragmenteve të ndryshme të baktereve. Antitrupa të ndryshëm
kundër fragmenteve individuale bakteriale pasqyrohen grafikisht si vija të zeza në letër nitroceluloze.

1. Për të kryer testin, kërkohen dy elementë kryesorë: serumi i gjakut i pacientit dhe bakteret e borreliozës së kultivuar të vrarë dhe të fragmentuar.

Mos e bëni këtë test menjëherë pas pickimit të rriqrës. Prisni të paktën 4 javë. Kostoja e hulumtimit Western Blotting në të dy klasat e antitrupave është rreth 2500-5000 rubla.

2. Nën ndikimin e rrymës elektrike, shpërndarja ndodh në faktorë, kryesisht baktere të marra nga një kulturë qelizore, duke përfshirë proteinat bakteriale (antigjenet). Këto proteina më pas transferohen në një membranë nitroceluloze. Membrana pritet në shirita.

3. Shiriti i antigjenit, në kombinim me serumin e gjakut të pacientit, ngjyroset duke përdorur teknikë e veçantë, i cili zbulon antitrupa të lidhur në mënyrë specifike me antigjenet Sprechete Borrelia.

4. Në zonat ku antitrupat e pacientit janë të lidhura me proteinat (antigjenet) e baktereve të borreliozës, vërejmë vija karakteristike (që tregojnë infeksion me bakteret Lyme). Rezultati i testit është pozitiv.

Çdo brez korrespondon me një proteinë bakteriale (antigjen). Nëse proteinat e qelizave Borreliosis dhe antitrupat nuk kombinohen, brezi nuk do të shfaqet. Atëherë rezultati është negativ.

Testi Western Blot - kur duhet bërë?

Diagnoza e hershme e sëmundjes Lyme është problematike për shkak të të ashtuquajturës dritare serologjike. Kjo është periudha nga fillimi i infeksionit deri në fillimin e trupit që prodhon antitrupa të zbulueshëm. Për sëmundjen Lyme, dritarja serologjike zgjat mesatarisht 4 javë.

Kryerja e testeve më pak se 4 javë pas pickimit të rriqrës paraqet rrezikun e marrjes së një rezultati të rremë negativ.

Testi Western Blot - rezultat pozitiv

Të kesh antitrupa kundër Borrelia do të thotë që ke sëmundjen Lyme. Megjithatë, është e vështirë t'i përgjigjemi pyetjes nëse infeksioni është aktiv apo jo.

Antitrupat IgG që rezultojnë nga infeksioni mund të zbulohen në gjak edhe 10 dhe ndonjëherë 20 vjet pas diagnozës së sëmundjes Lyme.

Ndodh gjithashtu që antitrupat e zbuluar Klasa IgM(zakonisht konsiderohet një shënues aktiv i infeksionit) mund të jetë i vazhdueshëm dhe gjithashtu nuk tregon infeksion aktiv.

Testi Western Blot - rezultat negativ

Testi mund të japë rezultat negativ në periudhën fillestare të sëmundjes, d.m.th. Në javët e para pas pickimit.

Western blotting mund të kryhet jo vetëm kur dyshohet për Lyme, por edhe kur infektohet me H. pylori (që shkakton ulçera peptike) ose HIV.

Testi Western blot mund të japë një rezultat të rremë negativ edhe në një situatë tjetër - kur në një borreliozë të vjetër kronike është ndalur prodhimi i antitrupave ose kur antitrupat janë përdorur plotësisht në luftën kundër kësaj sëmundjeje.

Nëse dyshimi për sëmundjen Lyme është i fortë, testi Western Blot duhet të përsëritet disa herë, për shembull, çdo disa javë, për të arritur në pikën ku antitrupat janë të pranishëm në gjak.

Prania e antitrupave në sëmundjen aktive Lyme ndryshon dhe një person që rezulton negativ ka një shans për të dalë pozitiv kur testohet përsëri disa javë më vonë. Ndonjëherë diagnoza konfirmohet vetëm pas herës së katërt ose të pestë.

Në këtë rast, disa mjekë përpiqen të marrin konfirmimin e infeksionit në një mënyrë tjetër: e trajtojnë pacientin me antibiotikë për disa javë dhe pas 5-6 javësh e dërgojnë për Western blotting.

Trajtimi me antibiotikë për një kohë të tillë nuk mund të shërohet sëmundje kronike, por ndryshon shumë sistemi imunitar se do të ketë mjaft antitrupa në gjak për t'u zbuluar. Rezultati i një testi Western blot duhet të interpretohet nga një mjek i specializuar në trajtimin e sëmundjes Lyme

Testi WB mund të kryhet edhe gjatë terapisë antibakteriale, por me antibiotikë gjasat për një rezultat pozitiv janë disi më pak të mundshme. Mënyra më e lehtë për të diagnostikuar sëmundjen me këtë test është 6 javë pas ndërprerjes së terapisë me antibiotikë.

E rëndësishme

Interpretimi i studimit është interpretimi i bandave. Si rregull i përgjithshëm, duhet të supozohet se sa më shumë breza, aq më e besueshme është diagnoza. Tre vija janë vërtet një besim i madh, dhe 5-6 vija nënkuptojnë sëmundjen Lyme me pothuajse 100% probabilitet.

Bandat IgM kanë një vlerë më të madhe diagnostike sepse sugjerojnë një fazë aktive të borreliozës së lindur nga rriqrat, megjithëse antitrupat e zbuluar në klasën IgM (bandat IgM) mund të jenë të vazhdueshme dhe të mos tregojnë infeksion aktiv. Rezulton se IgM është i lartë në fillim të infeksionit dhe në kundërshtim me logjikën gjatë sëmundje kronike Lyme.

Nivele të ngritura të antitrupave në Klasa IgG mund të konsiderohet si një infeksion i mbetur, ose nënkupton sëmundje kronike aktive.

Edhe një rezultat negativ i testit nuk do të thotë që sëmundja Lyme nuk është e pranishme. Një rezultat negativ i testit do të thotë vetëm se nuk ka antitrupa në gjak kundër baktereve të borreliozës - kjo mund të ndodhë, për shembull, kur bakteret kanë hyrë në trup dhe prodhimi i antitrupave nuk ka filluar ende (mjekët e quajnë këtë periudhë si dritare serologjike). .

Për shkak të shumëllojshmërisë së metodave të përdorura për të kryer këtë studim, është e vështirë të bëhen rekomandime universale në lidhje me interpretimin. Çdo laborator përdor kriteret e veta.

Sëmundja mund të zbulohet vetëm nga një mjek specialist bazuar në simptomat dhe rezultatet e testeve laboratorike. Testi Wester Blot nuk mund të interpretohet pa marrë parasysh simptomat.

Tabela e Përmbajtjes

GPM.1.7.2.0022.15 Përcaktimi i autenticitetit dhe pastërtisë së imunobiologjike barna Metoda Western blot

ARTIKU I PËRGJITHSHËM FARMAKOPE

Prezantohet për herë të parë

Kjo monografi e përgjithshme farmakopeale zbatohet për metodën Western blot, një nga variantet e imunoblotting-it, e cila përdoret për të vlerësuar origjinalitetin dhe pastërtinë e produkteve medicinale imunobiologjike (IMPs) të bazuara në proteina shumë të pastruara, përfshirë ato të marra duke përdorur teknologjinë e ADN-së rekombinante.

Në fazën e parë, elektroforeza kryhet në xhel poliakrilamid me dodecil sulfat natriumi (e ashtuquajtura elektroforezë SDS-PAGE) për të ndarë proteinat. Proteinat më pas transferohen në një membranë nitroceluloze ose membranë PVDF. Zbulimi kryhet duke përdorur antitrupa specifikë për proteinën që zbulohet, të lidhur me të fosfataza alkaline ose peroksidazën e rrikë (versioni i drejtpërdrejtë i ELISA), ose duke përdorur në mënyrë sekuenciale antitrupat e parë ndaj proteinës që përcaktohet, dhe antitrupat e dytë (i ashtuquajturi serum antiglobulin), specifik për imunoglobulinën e antitrupave të parë të konjuguar me fosfatazë alkaline ose rrikë peroksidaza (versioni indirekt i ELISA).

Ky OFS përshkruan një metodë zbulimi të bazuar në një reaksion ngjyre, si një nga më të përdorurat aktualisht. Për zbulimin, mund të përdoren gjithashtu metoda kemilumineshente, duke përfshirë kimilumineshencën e zgjeruar dhe metodat e etiketimeve radioaktive ose fluoreshente (RIA ose RIF).

Testi kryhet me substanca farmaceutike ose produkte të gatshme.

Gjatë vlerësimit të autenticitetit, në fazën e elektroforezës, përveç mostrave të provës, duhet të shtohen zgjidhjet e mëposhtme në pusetat e xhelit: një kampion kontrolli negativ (buferi i përgatitjes së mostrës 1-fish), një përzierje e shënuesve të peshës molekulare (përdorimi i Rekomandohen shënues të peshës molekulare të ngjyrosur paraprakisht), një mostër standarde e proteinës që testohet (nëse disponohet), e çertifikuar në mënyrën e përcaktuar. Kur vlerësohet pastërtia (papastërtitë), duhet të sigurohet masa shtesë për shtimin e një kampioni me një përqendrim proteine ​​që korrespondon me kufirin e zbulimit ose sasisë së papastërtive (në varësi të qëllimit të metodës) dhe të vendosur në bazë të rezultateve të metodës. vërtetimi. Kur vlerësohet pastërtia, është e nevojshme të krahasohen rezultatet e blotit me rezultatet e elektroforezës së xhelit të poliakrilamidit; teknika duhet të zbulojë 1% papastërti.

Metodologjia

Për të ndarë proteinat sipas peshës së tyre molekulare, elektroforeza kryhet fillimisht në përputhje me procedurën e përshkruar në Monografinë e Farmakopesë së Përgjithshme "Elektroforeza në xhel poliakrilamide".

Për të kryer transferimin e proteinave, përdoret një pajisje për transferimin e proteinave. E gjithë puna kryhet duke përdorur doreza gome. Vëllimi i të gjitha solucioneve të përdorura duhet të jetë i mjaftueshëm për të zhytur plotësisht membranën në të cilën transferohen proteinat.

Pas elektroforezës për përgatitjen e xhelit për imunoblotting, ai mbushet me një tretësirë ​​tampon për transferimin e proteinave (përveç rasteve kur tregohet ndryshe në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator), vendoset në një shaker orbital dhe mbahet për 10-15 minuta. Më pas përgatitet një fletë nitroceluloze ose membranë PVDF që korrespondon me madhësinë e xhelit. Kur përdoret një membranë nitroceluloze, fleta mbahet për 5 minuta në ujë të deionizuar, dhe më pas 5 minuta në një tretësirë ​​tampon për transferimin e proteinave (përveç rasteve kur tregohet ndryshe në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator). Kur përdorni një membranë PVDF, ajo duhet të mbahet në një tretësirë ​​metanoli ose alkooli për 10-15 minuta dhe më pas duhet të kryhen të njëjtat hapa si për një membranë nitroceluloze.

Për të transferuar proteinat në një membranë nitrocelulozë ose PVDF, mblidhet një "sanduiç". Për ta bërë këtë, një sfungjer i veçantë i përfshirë me pajisjen e transferimit të proteinave laget me tretësirë ​​tampon transferimi të proteinave dhe vendoset në një kornizë të veçantë plastike, mbi të cilën një deri në tre fletë letre filtri (për shembull, Whatman 3MM), të prera paraprakisht për t'u përshtatur. madhësia e membranës dhe proteinat e njomura në tretësirën e transferimit. Sipër vendoset një xhel, në sipërfaqen e të cilit vendoset me kujdes një fletë e përgatitur me membranë nitroceluloze ose PVDF (pa flluska ajri). Nga një deri në tre fletë letre filtri, të lagur paraprakisht në një tretësirë ​​të transferimit të proteinave, vendosen në membranë dhe mbulohen nga sipër me një sfungjer të dytë special të njomur në një zgjidhje transferuese proteinash. Korniza fiksohet me kapëse dhe zhytet ngadalë në një pajisje elektroforeze të mbushur me një zgjidhje të transferimit të proteinave, me fletën e membranës përballë anodës. Ndizni pajisjen. Transferimi elektroforetik i proteinave kryhet në temperaturën e dhomës për 25 minuta, duke vendosur kufirin aktual në shpejtësinë A max = 2 mA/cm 2 (për shembull, për një xhel me përmasa 10 × 10 cm 2 A max = 200 mA), përveç rasteve kur tregohet ndryshe në artikullin ose dokumentacionin rregullator të farmakopesë.

Lejohet përdorimi i pajisjeve për transferimin gjysmë të thatë të proteinave nga xheli në membranë në përputhje me udhëzimet për përdorimin e tij.

Pas përfundimit të transferimit, "sanduiçi" çmontohet. Membrana lahet me solucion fiziologjik të puferuar me fosfat (PBS).

Plotësia e transferimit të proteinave vlerësohet vizualisht nga transferimi i shënuesve të peshës molekulare me ngjyrë, të gjitha brezat kryesore të proteinave të të cilave duhet të zbulohen në membranë.

Zbulimi

Për të zbuluar rezultatet e metodës Western blot, ilaçi testues trajtohet (hibridizohet) me antitrupa. Për ta bërë këtë, membrana me proteinat e transferuara në të vendoset në një enë me një zgjidhje tampon bllokues dhe inkubohet në një shaker orbital për 30-60 minuta (përveç rasteve kur parashikohet ndryshe në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator) për të parandaluar thithjen jospecifike të antitrupa në membranë.

Pas kësaj, lani membranën në një tretësirë ​​tampon larës tre herë për 5 minuta, përveç nëse specifikohet ndryshe në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator.

Pastaj membrana trajtohet me një tretësirë ​​të antitrupave të parë ndaj proteinës që analizohet, e përgatitur duke përdorur një tretësirë ​​tampon për antitrupa (përveç rasteve kur tregohet ndryshe në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator) menjëherë përpara përdorimit në përputhje me udhëzimet për përdorim. Trajtimi me antitrupa kryhet në temperaturën e dhomës për 30-60 minuta (përveç nëse tregohet ndryshe në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator).

Më pas, membrana lahet tre herë për 5 minuta secila me një zgjidhje tampon për të hequr antitrupat e palidhur në një shaker orbital në temperaturën e dhomës, përveç nëse tregohet ndryshe në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator.

Pas larjes së membranës, trajtimi (hibridizimi) kryhet me një zgjidhje të antitrupave të dytë. Antitrupat poliklonalë ndaj imunoglobulinave të specieve shtazore që janë përdorur për të marrë antitrupat e parë përdoren si antitrupa të dytë. Këto antitrupa janë të konjuguar me një enzimë (peroksidazë rrikë ose fosfatazë alkaline). Për të kryer këtë hap, përsëritni procedurën e përshkruar më sipër, duke zëvendësuar tretësirën e parë të antitrupave me një tretësirë ​​të dytë të antitrupave. Pastaj membrana lahet për të hequr antitrupat e dytë të palidhur, të ngjashëm me të parën.

Zhvillimi i modelit imunoblot në membranë kryhet me një zgjidhje të substratit tetrametilbenzidine (TMB) për antitrupat e konjuguar me peroksidazën e rrikës, ose një zgjidhje për zhvillimin e fosfatazës alkaline - kur përdorni antitrupa të konjuguar me fosfatazën alkaline (përveç nëse tregohet ndryshe në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator).

Reagimi ndërpritet duke e larë blotin me ujë të dejonizuar. Uji i tepërt hiqet nga sipërfaqja e membranës me letër filtri dhe thahet në ajër në një vend të errët.

Vlerësimi i rezultateve

Gjatë vlerësimit të autenticitetit, brezat me ngjyra kryesore në membranën e zhvilluar duhet të korrespondojnë me brezat me ngjyra kryesore në elektroferogram.

Sasia e substancës së analizuar dhe përmbajtja e papastërtive, si dhe raporti i tyre, vlerësohen në mënyrë densitometrike.

Kriteret e përshtatshmërisë së sistemit

Rezultatet e metodës Western blot mund të merren parasysh nëse:

• Shënuesit e peshës molekulare shpërndahen në mënyrë të barabartë përgjatë gjithë gjatësisë së gjurmës përkatëse të xhelit;
• njolla tregon të gjitha shiritat kryesore të identifikuara kur xheli lyhet me Coomassie blu të ndezur R-250 ose G-250;
• identifikohet një mostër me përqendrimin minimal të përcaktuar në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator

Kriteret e pranimit të rezultateve

• Përputhja e njollës së mostrës së provës me blotin e kampionit të referencës, për shembull, kampionit standard përkatës të bazuar në proteinën (substancën) e pastruar;
• pajtueshmëria e peshës molekulare të komponentit kryesor të identifikuar me kërkesat e specifikimeve;
• përputhshmëria e përmbajtjes së papastërtisë së zbuluar në kampionin standard me diapazonin e vendosur në certifikatën për kampionin standard.

Metoda Western blot për përcaktimin e identitetit dhe pastërtisë duhet të përdoret me karakteristika të vërtetuara të vërtetimit për specifikën dhe kufirin e zbulimit të papastërtisë.

Karakteristikat e vërtetimit të metodës

Kur përdoret një metodologji për vlerësimin e autenticitetit, është e nevojshme të arsyetohen kriteret për pranueshmërinë e rezultateve; Këshillohet përdorimi i një kampioni standard të bazuar në proteina të pastruar, të çertifikuar në mënyrën e përcaktuar.

Kur përdorni një metodë për të vlerësuar pastërtinë, është e nevojshme të justifikoni kufirin e zbulimit të papastërtisë. Kur bëni një përcaktim sasior, është e nevojshme të justifikoni kufirin e përcaktimit sasior të një papastërtie, të tregoni diapazonin linear kur përcaktoni përbërësin kryesor dhe papastërtitë, saktësinë dhe korrektësinë e metodës. Për këtë qëllim, këshillohet përdorimi i një kampioni standard të bazuar në proteina të pastruar. Kur bëhen ndryshime në metodën e specifikuar në monografinë farmakopeale ose në dokumentacionin rregullator, duhet të konfirmohen karakteristikat e vërtetimit të metodës së miratuar më parë. Ndryshimet e mëposhtme i nënshtrohen vërtetimit:

• përdorimi i numrave të ndryshëm të mostrave të aplikuara në xhel;
• ndryshimi i kushteve për transferimin e proteinave nga xheli në membranë, duke përfshirë ndryshimin e pajisjeve të përdorura;
• ndryshimet në përbërjen e tretësirave tampon;
• ndryshimi i metodës së zbulimit të substancës testuese.

Shënime

1. Tretësirë ​​buferike për transferimin e proteinave pH 8.3. Nëse nuk ka udhëzime të tjera në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator, përdorni një nga metodat për përgatitjen e solucioneve të përshkruara më poshtë (shih Opsionin 1 dhe Opsionin 2). Zgjidhja e transferimit mund të përdoret 2-3 herë. Tretësira ruhet për 6 muaj në një temperaturë prej 4 deri në 8 0 C.

Opsioni 1. 7,86 g tris(hidroksimetil)aminometan, 33,75 g glicinë vendosen në një gotë të shkallëzuar me kapacitet 3000 ml, shtohen deri në 2400,0 ml ujë të deionizuar dhe trazohen në një përzierës magnetik deri në tretje të plotë. Matet pH, i cili duhet të jetë i barabartë me 8,3 - 8,4 (nuk lejohet rregullimi i pH-së së tretësirës me acid ose alkali). Shtoni 600.0 ml alkool dhe përzieni.

Opsioni 2. 5,8 g tris(hidroksimetil)aminometan, 2,9 g glicinë, 11,55 ml solucion dodecil sulfat natriumi 10% vendosen në një gotë të shkallëzuar me kapacitet 1000 ml, shtohen 800,0 ml ujë të dejonizuar dhe trazohen në një trazues magnetik. shpërbërja e plotë, matet pH (8,3-8,4). Shtoni 200.0 ml metanol 100% dhe përzieni. Nëse përdoret një membranë PVDF, atëherë dodecil sulfati i natriumit përjashtohet nga tretësira tampon dhe sasia e alkoolit zvogëlohet në 100.0 ml, duke rritur kështu vëllimin e ujit të shtuar në 900.0 ml.

1. I kripur i puferuar me fosfat (PBS), pH 7.2(nëse nuk tregohet ndryshe në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator). 4500,0 ml ujë të dejonizuar hidhet në një enë të graduar dhe shtohet radhazi: 40,0 g klorur natriumi, 1,0 g klorur kaliumi, 5,75 g fosfat natriumi i zëvendësuar 2-ujor, 1,0 g kripë kaliumi i shtuar është foshub. shpërbërja e plotë e të mëparshmes). Vendoseni pH në 7.2 me një zgjidhje 70%. acid fosforik ose një tretësirë ​​prej 45% hidroksid natriumi. Rregulloni volumin në 5000.0 ml me ujë të dejonizuar. Tretësira filtrohet dhe ruhet për 3 muaj në temperaturën 4 - 8 0 C.
2. Zgjidhje tampon për larje. Shtoni 5,0 ml të një solucioni 10% Tween-20 në një balonë vëllimore 1000 ml, rregulloni volumin e tretësirës në shenjë duke përdorur PBS dhe përzieni. Tretësira ruhet për 1 muaj në një temperaturë prej 4 °C deri në 8 °C.
3. Zgjidhje tampon bllokues. Në 100,0 ml tretësirë ​​tampon për larje, shtoni 5,0 mg albuminë të serumit të gjedhit (ose proteina tjetër), përveç nëse tregohet ndryshe në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator, dhe përzieni derisa të treten plotësisht. Tretësira përgatitet para përdorimit.
4. Zgjidhje tampon antitrupash. Në 100,0 ml tretësirë ​​tampon për larje, shtoni 2,0 mg albuminë të serumit të gjedhit (ose proteina të tjera), përveç nëse tregohet ndryshe në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator, dhe përzieni derisa të treten plotësisht. Tretësira përgatitet para përdorimit.

1. Zgjidhja TMB— zgjidhje për zhvillimin e peroksidazës së rrikës. Përdorni substratin TMB, gati për përdorim.
2. Zgjidhje për zhvillimin e fosfatazës alkaline. Shkrihet 1 tabletë e substratit BCIP/NBT në 10,0 ml ujë të dejonizuar. Zgjidhja përgatitet menjëherë para përdorimit.

Pasi ADN-ja, ARN-ja ose proteinat ndahen, ato duhet të transferohen në një mbështetje solide për zbulimin dhe operacione të tjera që janë të vështira për t'u bërë në një xhel. Procesi i transferimit që çon në imobilizimi i molekulave , d.m.th. fiksuar në gjendje të palëvizshme quhet fshirje (në anglisht - fshirje ). Si substrat përdoren membranat najloni ose nitroceluloze.

Blotting(nga anglishtja blotting - blotting) është një metodë e transferimit të fragmenteve elektroforetike të ADN-së në një film (membranë) të veçantë të bërë nga nitrocelulozë që lidh (imobilizon) molekulat e ADN-së me një fije floku.

Njoftim jugor(sipas emrit të autorit që e propozoi) bazohet në lëvizjen e fragmenteve të ADN-së për shkak të efektit kapilar. Procesi i transferimit të fragmenteve të ADN-së të përfshira në një xhel agarozë në një film nitrocelulozë duke përdorur letër filtri është i ngjashëm me blotting.

Analiza kryhet si më poshtë:

– ADN-ja e izoluar, e pastruar, e denatyruar dhe e fragmentuar vendoset në një fletë xheli agaroze, ku fragmentet ndahen elektroforetikisht sipas masës dhe ngarkesës.

– Një fletë xheli agaroze vendoset në letër filtri të lagur me tretësirë ​​të kripur (bufer) të koncentruar.

– Më pas një filtër nitrocelulozë aplikohet në xhel, ku ndodh imobilizimi (ose adsorbimi, ose fiksimi) i fragmenteve të ADN-së me një fije floku.

– Mbi filtrin vendoset një pirg fletësh letre filtri të thatë, e cila siguron një rrjedhje të ngadaltë të tretësirës tampon përmes xhelit (d.m.th., shërben si një lloj pompe kapilar). Zgjidhje fiziologjike, duke kaluar nëpër një xhel agaroze, mbart me vete fragmente të ADN-së që mbahen nga nitroceluloza dhe lidhen me të, dhe tretësira përthithet nga letra e thatë filtri.

– Më pas, ADN-ja denatyrohet me alkali dhe filtri mbahet në vakum në temperaturën 80 0 C, si rezultat i të cilit fragmentet e ADN-së me një fije floku imobilizohen (fiksohen) në mënyrë të pakthyeshme në nitrocelulozë. Në këtë rast, vendndodhja e brezave të ADN-së të imobilizuara korrespondon saktësisht me vendndodhjen e tyre në xhel.

– ADN-ja e lidhur me filtrin vendoset në një tretësirë ​​me një sondë të etiketuar me ADN, në të cilën ndodh hibridizimi. Vetëm fragmentet e ADN-së plotësuese të saj do të hibridizohen (formojnë lidhje hidrogjeni) me një sondë specifike, e cila mund të zbulohet si vija të lehta në film me rreze x, d.m.th. Autoradiografia e një filtri nitrocelulozë

Njoftim me pika. Për të përgatitur pika pika, një preparat ADN ose ARN aplikohet direkt në filtër. Pikat e barit duken si pika në filtër, gjë që shpjegon emrin e llojit të blotting-it (pika angleze). 1) Nga ADN gjenomike e para-trajtuar me ultratinguj, formohen fragmente 5-10 çifte nukleotide të gjata.

2) Për t'i bërë sondat e ADN-së ose ARN-së të aksesueshme për sondën, ato duhet të denatyrohen, d.m.th. konvertohet në formë me një zinxhir. Kjo ndodh nën ndikimin e një temperature prej 100 °C.

3) Acidet nukleike të denatyruara inkubohen në akull: një rënie e shpejtë e temperaturës pengon rinatyrimin e tyre, d.m.th. çiftimi plotësues i zinxhirëve. ADN ose ARN e denatyruar aplikohet direkt në filtër, i cili inkubohet në një tretësirë ​​që përmban sondë.

4) Për të parandaluar që acidi nukleik i analizuar të hyjë në tretësirë, ai duhet të fiksohet në një filtër (membranë). Për këtë përdoren dy lloje filtrash: nitrocelulozë dhe najloni.

Për të imobilizuar acidet nukleike në një filtër nitrocelulozë, skuqja përdoret në 80 °C në vakum dhe në një filtër najloni, rrezatimi UV përdoret për 3-5 minuta.

5) Pas inkubimit të preparatit të acidit nukleik me një sondë të etiketuar me izotop, autoradiografia kryhet në një kasetë të veçantë ose identifikimi duke përdorur metoda jo radioaktive.

Njohja me pika ju lejon t'i përgjigjeni vetëm një pyetjeje: nëse sekuenca e dëshiruar e nukleotideve është e pranishme në një mostër të caktuar.

Analiza e pikave veriore zbatohet:

1) për të izoluar dhe analizuar ARN (për shembull, për të përcaktuar nëse mRNA e lexuar nga një gjen i caktuar është i pranishëm në një lloj qelize të caktuar, d.m.th. nëse gjeni është i shprehur apo jo;

2) për të përcaktuar sasinë e kësaj ARN dhe ndryshimet e saj në zhvillimin e një lloji të caktuar qelize;

3) për të përcaktuar madhësinë e një transkripti të një gjeni.

Në këtë rast, molekulat e ARN-së të izoluara nga qeliza ndahen sipas madhësisë duke përdorur elektroforezën e xhelit dhe më pas transferohen në një filtër. Pas hibridizimit me një sondë njëvargëshe të etiketuar, identifikohen vendet e hibridizimit (homologjisë) të ARN-së dhe sondës.

Nëse sekuenca nukleotide e gjenit të dëshiruar (ose mARN) nuk dihet, por dihet proteina sintezën e së cilës kontrollon, atëherë është e mundur të izolohet një sasi e vogël e proteinës së pastër dhe të përcaktohet sekuenca e aminoacideve të një pjese të saj (njohuri mjafton 5-6 mbetje aminoacide). Duke përdorur tabelën e kodit gjenetik, është e mundur të vendosen të gjitha sekuencat e mundshme nukleotide në seksionin e mRNA (ose vetë gjenin) që kodon një sekuencë të caktuar aminoacide. Në këtë rast, një sondë mund të sintetizohet për të kërkuar klonet e dëshiruara në një bibliotekë gjenesh.

Western blottinG(immunoelectroblotting, protein blotting) është një metodë për identifikimin e proteinave unike. Ai bazohet në fenomenin e ndërveprimit antigjen-antitrup shumë specifik. Kështu, antigjeni (objektivi) është proteina që përcaktohet, dhe sonda është antitrupi ndaj saj.

Përftohen antitrupa ndaj proteinës në studim në mënyra të ndryshme. Më e thjeshta është të injektoni një mostër proteine ​​të pastruar në qarkullimin e gjakut të një kafshe laboratori (zakonisht një lepur). Trupi i tij prodhon antitrupa (imunoglobulina) ndaj kësaj proteine ​​të huaj. Këto janë antitrupa parësorë që do të ndërveprojnë me proteinën e synuar.

Megjithatë, nuk do të ishte praktike të futej një etiketë identifikimi direkt në të dhënat e antitrupave. Zbulimi i proteinave të ndryshme do të kërkonte etiketimin e antitrupave të ndryshëm, gjë që do të rezultonte në kosto të larta. Doli të ishte më e arsyeshme për t'u përdorur antitrupa universale – antiimunoglobulinat e konjuguara, të cilat janë në thelb antitrupa ndaj antitrupave të prodhuar duke përdorur proteinën e identifikuar si antigjen. Për shembull, anti-imunoglobulinat e konjuguara me Ig të lepurit do të ndërveprojnë me të gjitha imunoglobulinat e sintetizuara te lepujt ndaj antigjeneve të ndryshëm. Kështu, janë pikërisht antitrupat dytësorë universalë që mbajnë një etiketë izotopike ose jo radioaktive. Përveç një etiketimi jo-izotopik, i cili në rrjedhën e një sërë reaksionesh çon në formimin e një përbërjeje me ngjyrë të patretshme (si në rastin e blotimit të acidit nukleik), një etiketë kimilumineshente, e cila ka një ndjeshmëri më të lartë, është shumë përdoret shpesh.

1) Nxjerrja e proteinave nga homogjenati

2) Ndarja e proteinave sipas peshës molekulare duke përdorur elektroforezën e xhelit SDS-polyakrilamid (PAGE). Metoda e elektroforezës SDS përfshin denatyrimin e proteinave vendase. Kështu, molekulat e proteinave me të njëjtën peshë molekulare do të udhëtojnë në të njëjtën rrugë në xhel dhe do të rreshtohen në formën e një shiriti. Meqenëse përzierja përmban molekula proteinash të madhësive të ndryshme, formohen shumë breza. Rezultatet e elektroforezës mund të vizualizohen nga ngjyrosja e proteinave (Coomassie blu brilliant, amido zi, argjendi). Ngjyrosja e argjendit ka një ndjeshmëri unike që lejon zbulimin e aq pak sa 0,1 ng proteine ​​në brezin që rezulton. Kjo është shumë e rëndësishme për të kontrolluar sasinë e proteinës së aplikuar në xhel.

3) Transferimi i proteinave nga xheli në membranë. Kjo është bërë sepse poliakrilamidi nuk lejon që molekulat e mëdha të imunoglobulinës të shpërndahen në proteinë. Dhe proteina e imobilizuar në membranë bëhet e arritshme për antitrupat. Ndryshe nga blotimi i acidit nukleik, transferimi i proteinave në membranë ndodh nën ndikimin e forcave elektrike, d.m.th. në një fushë elektrike.

4) Njolla që rezulton inkubohet me antiserum ndaj proteinës, dhe më pas me antiimunoglobulina. Rezultati vizualizohet sipas llojit të etiketës së përdorur.

Kufizimet:

1) madhësia e madhe e fragmenteve në studim, duke tejkaluar ndjeshëm gjatësinë e sondave të ADN-së dhe duke parandaluar analizën e drejtpërdrejtë molekulare;

2) pamundësia e zgjedhjes arbitrare të skajeve të sekuencave të studiuara, e përcaktuar nga prania e vendeve përkatëse të kufizimit në molekulën origjinale të ADN-së;

3) nevoja sasi e madhe ADN gjenomike me peshë të lartë molekulare të pastruar mirë (të paktën 10 μg për reaksion, që është e barabartë me 0,5-1 ml gjak),

4) për hibridizimin gjenomik - prania e sondave radioaktive të ADN-së me aktivitet të lartë specifik prej të paktën 109 impulse/min * μg), që funksionojnë për një periudhë të kufizuar kohore dhe një njësi izotopi të pajisur posaçërisht. Për më tepër, ekspozimi i zgjatur i autografeve zgjat ndjeshëm kohën për të marrë rezultate.

5) intensitet i lartë i punës kërkimore

Analiza Western blot për të testuar sasinë e kalpastatinës përfshin ndarjen e proteinave të indeve (30 μg për korsi) me elektroforezë në 12% PAGE në prani të SDS (Laemmli, 1970) e ndjekur nga transferimi gjysmë i thatë i polipeptideve në një membranë nitroceluloze. tampon: 48 mM Tris-HCl, 39 mM glicinë, 0.0375% SDS, 20% metanol, pH 9.2). Pas inkubimit (2 orë, 20°C) të membranës në tampon TBS (bufer 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,5), vendet lidhëse jo specifike u bllokuan me një zgjidhje 5% të qumështit të skremuar në tampon TBST (TBS me shtimin e 0.1% Tween 20, pH 7.5) për 1 orë Më pas, membrana u ekspozua në mënyrë sekuenciale ndaj antitrupave poliklonalë ndaj kalpastatinës (hollimi 1: 2500 në tampon TBST; 1 orë) dhe me antitrupa ndaj IgG të lepurit (konjuguar me peroksidazë). hollimi 1: 2000 në tampon TBST 1 orë); Secili prej këtyre hapave u përfundua duke larë të përsëritur me tampon TBST. Membrana iu nënshtrua trajtimit standard me sistemin Immune-Star (Bio-Rad, SHBA).

2.3.6 Metoda të tjera

Përqendrimi i proteinave fraksionet u përcaktuan me metodën Bradford (Bradford, 1976) duke përdorur albuminën e serumit të gjedhit (BSA) si standard.

Densitometria vija në zimogramë dhe film me rreze X u kryen duke përdorur programin standard "Image J".

Përpunimi statistikor i të dhënave u kryen duke përdorur metoda të pranuara përgjithësisht të statistikave të variacionit duke përdorur paketat softuerike MS Excel dhe StatGraphics. Rëndësia e diferencave u vlerësua duke përdorur testin joparametrik U (testi Wilcoxon-Mann-Whitney), si dhe duke përdorur analizën e variancës në një drejtim (Korosov, Gorbach, 2007).

Kapitulli 3. Rezultatet e kërkimit dhe diskutimi

3.1. Sistemi i kalpainës/kalpastatinës në minjtë e nënshtruar neurodegjenerimit të shkaktuar nga beta-amiloide gjatë terapisë me estrogjen

Neurodegjenerimi u shkaktua në minjtë më të vjetër Wistar grupmoshat– 12 dhe 24 muaj. Efekti eksperimental konsistonte në administrimin intracerebral të një fragmenti 42-anëtarësh të proteinës pararendëse amiloide - Abeta(1-42) (një model eksperimental i sëmundjes së Alzheimerit), si dhe administrimi i kombinuar intracerebral i peptidit beta-amiloide dhe administrimi intranazal i një neuroprotektor (estradiol). Midis kafshëve u identifikuan: grupi i kontrollit - i operuar me shami (2 μl tretësirë ​​të kripur në zonën e hipokampusit të djathtë); grupi i parë eksperimental - 2 μl zgjidhje peptide Abeta (1-42) (që korrespondon me 5 μg peptid) në zonën e hipokampusit të djathtë; grupi i dytë eksperimental - pas një injeksioni të ngjashëm të peptidit Abeta(1-42), administrimi ditor intranazal i 0.1 mg 17-beta-estradiol.

U zbulua se në prani të peptidit amiloidogjen në ind nervor aktivizohet sistemi i kalpainës dhe shkalla e aktivizimit lidhet pozitivisht me intensitetin e vdekjes së qelizave të indit nervor (densiteti i neuroneve). Rregullimi i kalpainës mund të kryhet si në nivelin e sintezës së proteinës enzimë (ose formave të saj individuale - produkte të gjeneve të ndryshme), dhe në nivelin pas përkthimit për shkak të proceseve të autolizës, lidhjes me frenuesin endogjen kalpastatin ose tek rregullatori alosterik - kalciumi.

Rritja e grupit të kalpainave të autolizuara (118 kDa) e zbuluar nga zymografia e kazeinës në grupin e kafshëve nr. 2 pasqyron aktivizimin e kalpainave in vivo. Aktivizimi i vëzhguar i m-kalpainës (120 kDa), me sa duket, si në shumë situata të tjera, shoqërohet me kalcium të tepërt në citoplazmë. Një tjetër konfirmim i kësaj rruge të rregullimit të aktivitetit të kalpainës është niveli i qëndrueshëm i frenuesit të tyre, kalpastatinës, i zbuluar në studimin tonë.

Siç doli, terapia me estradiol anulon efektin e hiperaktivizimit të kalpainës, me uljen e aktivitetit të përgjithshëm të kalpainës në indin nervor dhe aktivitetit të fraksioneve individuale. Në prani të estradiolit, një pjesë më e vogël e prekursorit të kalpainës i nënshtrohet autolizës dhe, rrjedhimisht, aktivizimit. Nevojiten studime të mëtejshme të mekanizmit të rregullimit të aktivitetit të kalpainës në kafshët eksperimentale, në veçanti, nevojiten eksperimente që synojnë përcaktimin e burimit të kalciumit të tepërt dhe gjetjen e mjeteve për të parandaluar këto rryma patologjike.

Niveli i sintezës së proteazomës në indet e trurit është i ulët në krahasim me organet e tjera dhe tenton të ulet me moshën (kur krahasohen treguesit në kafshët 18, 24 dhe 30 muajsh), siç gjykohet nga sasia e alfa-1,2,3 ,5,6 ,7 nënnjësi proteazome që formojnë unaza alfa të grimcave bërthamore 20S, universale për proteazomet 20S dhe 26S.

Ndryshimet në nivelin e shprehjes dhe aktivitetit të katepsinave në zona të ndryshme të trurit te kafshët eksperimentale u konfirmuan. Në eksperimentin tonë, administrimi intracerebral i peptidit beta-amiloide çoi në një rritje të konsiderueshme (p<0,05) экспрессии гена катепсина D в коре (правом полушарии) головного мозга крыс по сравнению с животными контрольной группы. В неокортексе крыс, которые после введения бета-амилоидного пептида получали эстрадиол, относительный уровень экспрессии данного гена не отличался от контрольных значений, то есть восстанавливался до нормального уровня. В области правого гиппокампа введение бета-амилоидного пептида привело к увеличению экспрессии гена катепсина D приблизительно в 7 раз (p<0,001). Последующее введение эстрадиола привело к еще большему возрастанию (в 30 раз) относительной экспрессии указанного гена (p<0,001).

Të dhënat tona treguan efekte të rëndësishme të beta-amiloidit dhe estradiolit në performancën njohëse te minjtë e vlerësuar duke përdorur labirintin e ujit Morris. Në minjtë femra dhe meshkuj të trajnuar më parë, pas injektimit të peptidit beta-amiloide në hipokampus, pati një (p<0,05) увеличилось время поиска скрытой подводной платформы. Последующее введение эстрадиола сокращало время поиска подводной платформы у животных обоих полов по сравнению с таковыми, получившими только бета-амилоид. При этом у самок время поиска уменьшилось более значимо (p<0,01), чем у самцов (p<0,05).

Rezultatet e mikroskopisë konfokale të seksioneve të trurit treguan se administrimi i peptidit beta-amiloide çoi në një rritje të konsiderueshme të nivelit të imunoreaktivitetit të tij në indet e hemisferës së djathtë dhe të majtë (në një masë më të vogël) të trurit. Këto rezultate, së bashku me të dhënat e sjelljes, demonstrojnë efektivitetin e ilaçit peptid amiloide të administruar dhe ofrojnë dëshmi të përfaqësimit të modelit të zgjedhur të sëmundjes Alzheimer. Administrimi i mëvonshëm i estradiolit reduktoi sasinë e beta-amiloidit në trurin e minjve në nivele pothuajse të kontrollit. Reduktimi i depozitave të amiloidit në minjtë e trajtuar me estradiol tregon fillimin e disa proceseve adaptive në indin nervor që synojnë përdorimin e tyre.

Mekanizmi i rolit neuroprotektiv të estradiolit ende nuk është kuptuar plotësisht, megjithëse ky fenomen është vërejtur për një kohë të gjatë. Përdorimi i estradiolit si një neuroprotektor diktohet nga disa arsye. Së pari, efekti neuroprotektiv i estradiolit është mjaft i njohur dhe i përshkruar në literaturë (McEwen et al., 2001; Asimiadou et al., 2005; Lebesgue et al., 2009). Së dyti, është treguar se estradioli është një neurosteroid në kuptimin e plotë të fjalës, pasi truri përmban të gjitha enzimat e nevojshme për sintezën e tij (Stoffel-Wagner, 2001; Reddy, 2010). Së treti, dihet se efekti neuroprotektiv i estradiolit shoqërohet me efektet e tij antioksiduese (Behl et al., 1997) dhe antiapoptotike (Asimiadou et al., 2005), pra me efekte të kundërta me ato të peptidit Abeta.

Rezultatet e marra mund të tregojnë një përgjigje adaptive të indit nervor ndaj futjes së një peptidi toksik. Disa publikime tregojnë se sistemi i autofagjisë lizozomale mund të përfshihet në degradimin e peptidit beta-amiloide (Nixon, 2007). Ka të ngjarë që estradioli të stimulojë autofagjinë e materialit proteinik; Kjo dëshmohet si nga të dhënat për përmbajtjen e peptidit Abeta në indet e trurit ashtu edhe nga vlerësimi i aktivitetit dhe nivelit të shprehjes së proteinazave lizozomale. Imunohistokimia fluoreshente zbuloi një ulje të sasisë së peptidit beta në minjtë që merrnin terapi neuroprotektive me estradiol.

Bazuar në të dhënat e marra në eksperiment, mund të nxirren përfundimet e mëposhtme. 1. Niveli i shprehjes së gjeneve të proteinazave lizozomale CtsD, CtsB, CtsL dhe nënnjësive alfa të proteazomave dhe aktiviteti i enzimave që ato kodojnë në korteksin cerebral të minjve zvogëlohet me plakjen. Përkundrazi, aktiviteti i kalpainave në kafshët e grupmoshave më të mëdha rritet. 2. Niveli i shprehjes dhe aktivitetit të katepsinës D, si dhe intensiteti i proteolizës së varur nga kalciumi, rritet ndjeshëm në hipokampus dhe korteksin cerebral të minjve pas administrimit intracerebral të peptidit beta-amiloide, dhe funksioni njohës i kafshëve vuan. . 3. Administrimi i estradiolit në sfondin e intoksikimit me beta-amiloide çon në një ulje të përmbajtjes së këtij peptidi në hipokampusin e minjve dhe një përmirësim të treguesve biokimikë dhe të sjelljes në kafshët eksperimentale. 4. Aktivizimi farmakologjik i funksionit lizozomal nga estrogjenet mund të nxisë heqjen e Abeta në sëmundjen e Alzheimerit; normalizimi i homeostazës së kalciumit në këtë situatë parandalon aktivizimin patologjik të sistemit kalpain dhe, në të njëjtën kohë, humbjen e neuroneve përgjatë rrugëve të vdekjes së qelizave të varura nga kalpaina.

Blotting(nga anglishtja" njollë" - spot) - transferimi i NC-ve, proteinave dhe lipideve në një mbështetje të fortë, për shembull, një membranë dhe imobilizimi i tyre.

• elektroforezë në xhel poliakrilamid:
o në kushte denatyrimi me shtimin e uresë - ndarja e NA-ve të shkurtra me një zinxhir;
o në kushte denatyrimi me shtimin e dodecilsulfatit të natriumit (elektroforeza Laemmli) - ndarja e proteinave sipas peshës molekulare;
o në kushte amtare - ndarja e proteinave sipas strukturës së tyre tredimensionale;
• fokusimi izoelektrik - për ndarjen e proteinave sipas pikës izoelektrike (pI);
• elektroforezë dydimensionale (2D) - për ndarjen e proteinave në dy drejtime - sipas pikës izoelektrike dhe sipas peshës molekulare;
• Elektroforeza e xhelit të agarozës - Ndarja NC:
o përgjatë gjatësisë së fragmenteve lineare;
o nga “supermbështjellja” e molekulave unazore;
• kromatografia me shtresë të hollë - ndarja e lipideve nga komplekset lipidike.

• difuzioni i molekulave - transport i ngadaltë, i përdorur shpesh për lipide;
• blotting kapilar - membrana shtypet kundër xhelit, mbi të vendoset një pirg letre filtri, buferi i transferimit lag xhelin dhe ngrihet nën veprimin e forcave kapilare, duke lagur letrën filtri dhe duke transferuar makromolekulat nga xheli në cipë; blotimi kapilar mund të kryhet:
o në dhomat me xhel të lagur me një tampon - transferim "gjysmë i thatë";
o në dhomat me zhytje me xhel në tampon;

• blotting me vakum - i ngjashëm me blotting kapilar, por transferimi përshpejtohet duke përdorur një vakum në vend të forcave kapilare të krijuara nga lagja e letrës filtruese;
• elektroblotting - transferimi i makromolekulave të ngarkuara në membranë ndodh nën ndikimin e një rryme elektrike;
• "qepja" e NC në membranë nën ndikimin e rrezatimit UV ose ngrohjes - për fiksimin përfundimtar në membranat najloni;
• dot blotting (slot blotting) - kampioni aplikohet në formën e një pike ose vizë direkt në membranë pa ndarje paraprake të molekulave në një xhel ose në një pllakë TLC.

• Membrana PVDF (fluorid poliviniliden);
• membranat NC (nitroceluloza);
• membranat najloni (përdoren për NDT).

• ngjyrosje - lidhja e një ngjyre (jonet e argjendit, Coomassie, Ponceau, bromidi etidium) drejtpërdrejt me makromolekulat e zbuluara;
• etiketimi imunokimik - etiketimi i makromolekulave ndodh për shkak të antitrupave të etiketuar që lidhen posaçërisht me to;
o imuno-ngjyrosja - antitrupat etiketohen me ngjyra, regjistrohet thithja e dritës me një gjatësi vale të caktuar;
o analiza e imunitetit enzimë - antitrupat etiketohen me një enzimë, regjistrohet sasia e produktit me ngjyrë të prodhuar gjatë reaksionit enzimatik (ELISA);
o kimilumineshent - antitrupat janë etiketuar me një enzimë raportuese, e cila lëshon një shkëlqim në prani të një substrati dhe emetimi i dritës regjistrohet
një gjatësi vale të caktuar;
o fluoreshente - antitrupat janë etiketuar me një etiketë fluoreshente, e cila ngacmohet nga drita e një gjatësi vale të caktuar, emetimi i dritës regjistrohet në
rajon me gjatësi vale më të gjatë;
• etiketimi i rrezatimit - etiketat e rrezatimit (radioizotopet) futen në makromolekulat, zbulimi kryhet duke përdorur:
o autoradiografi (duke aplikuar film fotografik në membranë);
o Imazhe radio (përcaktimi sasior i emetimeve të rrezatimit dhe ndërtimi i një tabloje të pozicionit relativ të shenjave);
• hibridizimi - lidhja e acideve nukleike me oligonukleotide të etiketuara me një strukturë plotësuese, si rregull, kryhet duke regjistruar emetimin e rrezatimit ose fluoreshencën e etiketës;
• spektrometria e masës - përdoret për analiza të drejtpërdrejta strukturore të lipideve.

• Njoftim jugor(Southern blotting) - emëruar pas Edwin Southern, i cili propozoi metodën - përcaktimi i sekuencës së ADN-së në një mostër dhe përcaktimi i numrit të kopjeve të gjenit në ADN gjenomike. Transferimi në membranë paraprihet nga tretja e kampionit me anë të kufizimit të endonukleazave në fragmente dhe fraksionimi i tyre me elektroforezë në një xhel agaroze. Analiza e membranës kryhet me hibridizimin me oligonukleotide të etiketuara me sekuencë të njohur;
• Northern blotting- përcaktimi i sekuencës së ARN-së në kampion dhe studimi i shprehjes së gjeneve (përcaktimi i mARN). Ngjashëm me Southern blotting, por molekulat e ARN-së të izoluara nga kampioni ekzaminohen, pa tretje endonukleaze. Ndarja molekulare kryhet në një xhel agarozë me shtimin e formaldehidit (për të denatyruar ARN) ose në një xhel poliakrilamid me shtimin e uresë (përdoret për analizën e mikroRNA). Imobilizimi i molekulave të ARN-së në membranë ndodh për shkak të ngrohjes nën vakum ose "lidhjes së kryqëzuar" duke përdorur rrezatimin UV;
• Western blotting- Imunobllotimi i proteinave është një metodë analitike që përdoret për të identifikuar proteinat specifike në një kampion. Transferimi në membranë paraprihet nga ndarja e proteinave në një xhel poliakrilamid. Analiza e proteinave në membranë kryhet në mënyrë imunokimike;
• far Western blotting- proteina blotting, që përdoret për të përcaktuar ndërveprimet protein-proteinë, e ngjashme me Western blotting-in, por në vend të antitrupave përdoren proteina të tjera që lidhen në mënyrë specifike me proteinën në studim;
• Njoftim jugor- përcaktimi i proteinave që lidhen me ADN-në dhe vendeve në molekulat e ADN-së me të cilat lidhen proteinat - e ngjashme me Western blotting, por pas denatyrimit të elektroforezës në një xhel poliakrilamid, proteinat lahen nga sulfati dodecil natriumi në prani të uresë dhe transferohen në membrana nitroceluloze me difuzion. Si mostër, përdoren fragmente të etiketuara të ADN-së me gjatësi të ndryshme, të marra duke ndarë një fragment më të madh të ADN-së gjenomike në studim. Molekulat e lidhura të ADN-së më pas lahen nga çdo kompleks protein-ADN dhe analizohen me elektroforezë me xhel poliakrilamid;
• Njolla lindore- përcaktimi i modifikimeve post-përkthimore të proteinave (lipide të lidhura, glikopolisakaridet, mbetjet e fosfatit) - të ngjashme me Western blotting, por antitrupat përdoren jo ndaj proteinave, por ndaj lipideve, glikopolisaharideve, etj. Përveç antitrupave, molekula të tjera proteinike që lidhen me subjektet e testimit (për shembull, lektina) përdoren gjithashtu si mostra;
• blotting larg-lindore- analiza e lipideve të ndara me kromatografi me shtresë të hollë me performancë të lartë. Transferimi në membranë zakonisht realizohet me difuzion. Regjistrimi kryhet me analizë të drejtpërdrejtë spektrometrike strukturore të masës.