Eritrociti. Struttura, carica, quantità, funzioni, caratteristiche del metabolismo
eritrociti
Gli eritrociti sono globuli rossi. Molto spesso hanno una forma biconcava. Il diametro di un eritrocita è 7,3 µm e la superficie è 145 µm2. Gli eritrociti hanno una forma biconcava - normociti 3D, e in tale forma non c'è un singolo punto nell'eritrocita che sarebbe a più di 0,85 micron dalla sua superficie ^ Se gli eritrociti fossero sferici, il centro della cellula sarebbe a una distanza di 25 micron, e la superficie totale sarebbe del 20% più piccola. Il rapporto tra area e volume, pari a 1,5, favorisce la deformabilità degli eritrociti e favorisce il trasferimento di ossigeno dai polmoni agli organi Una diminuzione di questo rapporto, osservata con un aumento del volume di un eritrocita, acquisendo una forma sferica, lo rende meno deformabile. Ciò porta alla rapida distruzione dell'eritrocita. Inoltre, questa forma consente di fissare l'eritrocita nella rete di fibrina durante la formazione di un trombo ^ £ tra gli eritrociti, oltre ai normociti, ci sono microciti (con d< 7,2 мкм) и макроцитьг^с d >8-9 µm). Discociti (normociti), planociti (con una superficie piana), stomatociti (a forma di cupola), sferociti (sferociti), echinociti (stiloide), ecc.
La membrana eritrocitaria è composta da 4 strati.
I due strati intermedi sono composti da fosfolipidi stabilizzati dal colesterolo. Aumentando il rapporto colesterolo/fosfolipidi nella membrana ne aumenta la viscosità, ne riduce la fluidità e l'elasticità. La deformabilità dell'eritrocita diminuisce.
I fosfolipidi sono il principale componente strutturale e funzionale delle membrane. Esistono quattro classi principali di fosfolipidi, che sono contenuti nella membrana eritrocitaria nelle seguenti concentrazioni: fosfatidilcolina - 28%, fosfatidiletanolamina - 27%, sfingomielina 26%, fosfatidilserina -13%.
La molecola fosfolipidica è composta da tre parti principali: una "testa" e due "code". "code" - catene allungate di acidi grassi, la composizione dei fosfolipidi della membrana eritrocitaria comprende acidi oleico, arachidonico, linoleico, palmitico e stearico. Nel doppio strato, le "teste" idrofile delle molecole fosfolipidiche formano le superfici superiore e inferiore della membrana, mentre le "code" idrofobiche della membrana sono attaccate l'una all'altra e sono nascoste nel suo spessore. Una caratteristica importante delle membrane è l'asimmetria del doppio strato - la diversa composizione dei lipidi nei suoi strati interni ed esterni L'asimmetria del doppio strato è creata e mantenuta dagli enzimi del metabolismo dei lipidi. Fornisce interazioni intercellulari: i fosfolipidi della membrana degli eritrociti vengono aggiornati a causa del loro scambio con i lipidi del plasma sanguigno. Durante il giorno viene scambiato il 25% di tutti i fosfolipidi di membrana.
Le proteine sono un altro componente importante della membrana insieme ai fosfolipidi. Differiscono per il grado di immersione nel doppio strato lipidico: alcuni si trovano superficialmente, formando lo strato esterno della membrana; altri lo trafiggono; il terzo - sostiene il doppio strato dal lato del citoplasma, formando lo strato interno. Interagendo tra loro, le proteine creano la cornice della membrana, garantendone la forza? Esiste una stretta relazione tra proteine e lipidi. I lipidi determinano la mobilità delle proteine e sono responsabili della plasticità e deformabilità delle membrane.
Le principali classi di proteine di membrana sono rappresentate da proteine integrali e periferiche.
Le proteine integrali sono strettamente associate al doppio strato lipidico, lo penetrano in tutto e per tutto e possono includere frammenti di lipidi e carboidrati nella loro composizione.
(La proteina-3 è la principale proteina integrale. Essa, interagendo con l'ankyrino "m> situato sul lato interno della membrana, fornisce un forte legame tra il doppio strato lipidico e le proteine periferiche. Le funzioni della proteina-3 sono le seguenti: è il principale vettore di anioni, contiene siti per il legame di gliceraldeide fosfato deidrogenasi, aldolasi, emoglobina. Sulla sua superficie esterna è presente un sistema antigenico che determina l'affiliazione di gruppo dell'eritrocita.
Le glicoforine formano grandi molecole sialoglicopeptidiche: parti glicosilate delle glicoforine, che trasportano gruppi carichi o recettori, contribuiscono alla loro diffusione a distanze considerevoli verso l'esterno dalla superficie delle membrane. La glicoforina A potenzia l'azione delle proteine transmembrana, contribuisce al rafforzamento e alla stabilizzazione del citoscheletro.
ATPasi di membrana - ce ne sono 3. Na * -K + -ATPasi rimuove Na + dall'eritrocita e introduce K +. Ca2+-ATP-asi - sposta il Ca2+ fuori dall'eritrocita quando è legato alla proteina calmodulina. Con un aumento della concentrazione di Ca2 * nel citoplasma, il lavoro della pompa del calcio viene migliorato, viene impedita la rottura dello scheletro della membrana_1\^2+ -ATPasi, che può essere un modulatore dei cambiamenti nella forma degli eritrociti. La funzione di tutte le ATPasi di membrana è quella di fornire energia per il trasporto attivo di ioni.
Le proteine periferiche sono caratterizzate da una minore profondità di penetrazione nel doppio strato e da una debole interazione con esso.
La spetrina è la principale proteina dello scheletro della membrana, che comprende anche altre proteine periferiche: actina, proteina-4.1 e proteina-4.9 (lega l'actina). Tutti sono localizzati sulla superficie citosolica della membrana e costituiscono la base dello scheletro della membrana, che ha una struttura forte e rigida.
L'acetilcolinesterasi - un enzima che catalizza la scomposizione dell'acetilcolina) si trova sul lato esterno della membrana degli eritrociti. La maggior parte degli enzimi della glicolisi sono orientati al citoscheletro della membrana eritrocitaria.
Le proteine che formano la membrana eritrocitaria svolgono molte funzioni: forniscono la forza del citoscheletro, controllano la costanza della composizione ionica del citoplasma con la partecipazione delle ATPasi di trasporto, partecipano al riconoscimento specifico di sostanze biologicamente attive, regolano il metabolismo intracellulare, determinano le proprietà immunitarie e forniscono anche il fabbisogno energetico della cellula.
A differenza delle membrane di altre cellule, la membrana eritrocitaria ha un'elevata permeabilità per C>2, CCL, HCO3, CG ed è scarsamente permeabile ai cationi Na+, K+, che passano lentamente attraverso i pori transmembrana.
Gli eritrociti dei mammiferi sono formazioni prive di nuclei con respirazione intrinseca molto bassa. Senza un nucleo, un eritrocita consuma 200 volte meno U2 delle cellule nucleari. Una diminuzione del consumo di Oi porta ad un aumento della durata della vita di un eritrocita. La loro principale fonte di energia è
il glucosio viene rilasciato. L'energia necessaria per mantenere la struttura e stabilizzare l'emoglobina è generata dalla glicolisi e dallo shunt pentoso.
1.5 Argomenti delle lezioni pratiche
SEZIONE 1. BIOFISICA DELLA MEMBRANA
1. 1. Membrane biologiche. Struttura, proprietà.
La capacità elettrica specifica della membrana assonale, misurata con un microelettrodo intracellulare, è risultata essere 0,5 microfarad/cm2. Usando la formula del condensatore piatto, stimare lo spessore dello strato idrofobico di una membrana con una costante dielettrica di 2.
Qual è la distanza sulla superficie della membrana eritrocitaria che una molecola di fosfolipidi percorre in 1 secondo a causa della diffusione laterale? Il coefficiente di diffusione laterale è preso pari a 10 -12 m 2 /s. Confronta con la circonferenza di un eritrocita con un diametro di 8 micron.
Durante la transizione di fase dei fosfolipidi di membrana dallo stato liquido-cristallino al gel, lo spessore del doppio strato cambia. Come cambierà la capacità elettrica della membrana in questo caso? Come cambierà l'intensità del campo elettrico nella membrana?
Con l'aiuto di molecole di fosfolipidi marcate con spin, è stato stabilito il gradiente di viscosità attraverso lo spessore della membrana. Descrivi l'ex esperimento. Dov'è la viscosità più alta: sulla superficie della membrana o al suo centro?
1.1.1. Spessore della membrana biologica:
10 A, 3. DE µm
10 nm 4. 10 µm
1.1.2. Il modello a mosaico fluido di una membrana biologica comprende:
strato proteico, polisaccaridi e lipidi di superficie
monostrato lipidico e colesterolo
doppio strato lipidico, proteine, microfilamenti
doppio strato lipidico
1.1.3. La parte lipidica della membrana biologica si trova nel seguente stato fisico:
liquido amorfo
solido cristallino
solido amorfo
cristalli liquidi
1.1.4. Capacità elettrica specifica della membrana assonale:
1.1.5. Il tempo di trasferimento caratteristico del trasferimento di una molecola fosfolipidica da una posizione di equilibrio all'altra durante la loro diffusione:
1.1.6. La transizione di fase del doppio strato lipidico delle membrane dallo stato liquido-cristallino al gel è accompagnata da:
assottigliamento della membrana
lo spessore della membrana non cambia
ispessimento della membrana
1.2. Trasporto di sostanze attraverso membrane biologiche.
Controlla le domande, i compiti, i compiti per i seminari
1. Da quali parametri dipende il raggio critico di un poro lipidico in una membrana?
2. Calcolare il raggio dei pori critico in assenza di potenziale di membrana. Prendi la tensione del bordo del poro 10 -11 N, la tensione superficiale del doppio strato lipidico 0,3 mN/m.
3. Come cambierà la diffusione facilitata degli ioni kaoium con la partecipazione della molecola di valinomicina dopo la transizione di fase dei lipidi di membrana dallo stato liquido-cristallino al gel?
4. La capacità elettrica specifica della membrana dell'assone, misurata con un microelettrodo intracellulare, è risultata essere 0,5 microfarad/cm2. Usando la formula del condensatore piatto, stimare lo spessore dello strato idrofobico di una membrana con una costante dielettrica di 2.
Test di monitoraggio del modello
1.2.1. Il trasporto ionico avviene nella direzione:
1.2.2. L'equazione di diffusione per i non elettroliti (Fika) è scritta:
2.3. La molecola di valinomicina trasporta attraverso la membrana:
1.2.4. Il trasferimento di materia durante la diffusione facilitata viene confrontato con la diffusione semplice:
Più lentamente
1.3. Potenziali bioelettrici.
Controlla le domande, i compiti, i compiti per i seminari
Quale trasporto di ioni crea una differenza di potenziale di membrana: passiva o attiva?
Quale è maggiore: la velocità di propagazione di un segnale elettrico lungo i fili di un telegrafo marino o la velocità di propagazione di un impulso nervoso lungo una membrana assonale? Come mai?
Spiegare il meccanismo biofisico d'azione del veleno Tetro-Dotoxin e dell'anestetico locale tetraetilammonio.
Come si correla la permeabilità della membrana dell'assone del calamaro per vari ioni a riposo e durante l'eccitazione?
Come cambierà la forma del grafico del potenziale d'azione se cambiamo la composizione chimica all'interno dell'assone e all'esterno: l'asso-plasma viene sostituito con fluido extracellulare e fluido extracellulare - con axoplasma?
Qual è l'intensità del campo elettrico sulla membrana a riposo, se la concentrazione di ioni potassio all'interno della cellula è 125 mmol / l, all'esterno - 2,5 mmol / l e lo spessore della membrana è 8 nm?
(Risposta: 1,3 * 10 7 V / m.)
7. Calcolare l'ampiezza del potenziale d'azione, se con-
concentrazione di potassio e sodio all'interno della cellula del tessuto eccitabile
né rispettivamente: 125 mmol / l, 1,5 mmol / l e al di fuori
2,5 mmol/l e 125 mmol/l.(Risposta: 160 mV.)
Test di monitoraggio del modello
1.3.1 Il potenziale di membrana f m è chiamato:
1.3.2. Diametro della punta dell'elettrodo intracellulare utilizzato per misure del potenziale di membrana:
commisurata alla dimensione cellulare
molto più piccolo della cellula
cellule molto più grandi
1.4. Meccanismo di generazione del potenziale d'azione.
Controlla le domande, i compiti, i compiti per i seminari
1. È possibile un processo sulla membrana di una cellula eccitabile, in cui fluiscono simultaneamente flussi di ioni diversi con lo stesso segno di carica?
2. Qual è il significato dell'espressione
per la fase II del potenziale d'azione dei cardiomiociti?
3. Qual è il motivo per cui la corrente attraverso il canale è discreta e attraverso la membrana - continua, che cambia dolcemente?
Test di monitoraggio del modello
1.4.1. Nella fase di depolarizzazione durante l'eccitazione dell'assone, i flussi di ioni Na+ sono diretti:
1. inferno 2. bd 3. inferno 4. in 5. ag
1. 4.2. Nella fase di ripolarizzazione dell'assone, i flussi ionici sono diretti:
1.ad 2.bd 3.be 4.d
4.3. Durata del potenziale d'azione dei cardiomiociti rispetto al potenziale d'azione dell'assone
1. maggiore di 2. minore di 3. uguale
4.4. La fase di plateau in un cardiomiocita è determinata dai flussi ionici:
1. Antonov VF. Biofisica delle membrane // Rivista educativa Sorovsky. - 1997. - T. - 6. S. 1-15.
2. Antonov V.F., Smirnova E.Yu., Shevchenko E.V. Membrane lipidiche durante le trasformazioni di fase. - M.: Nauka, 1992. - S. 125.
3. Klenchin VA membrane biologiche. - 1993. - T. 10. -S. 5-19.
4. Chizmajaev Yu.A., Arakelyan V.B., Pastushenko V.F. Biofisica delle membrane. - M.: Nauka, 1981. - S. 207-229.
5. Kotek A., Janacek K. trasporto di membrana. M.: Mir, 1980.
6. Lightfoot E. Fenomeni di trasporto nei sistemi viventi. M.: 1977.
7. Rubin A.B. Biofisica. M.: Più in alto. Shk., 1987.
8. Membrane biologiche: Collezione / Sotto. ed. DS Parsons. Mosca: Atomizdat, 1978.
9. Membrana: Canali ionici: Sat. Arte. M.: Mir, 1981.
10. Hills B.V. Sab. Membrana: canali ionici. M.: Mir, 1981.
11. Fisiologia e fisiopatologia del cuore. Sotto. ed. N. Sperelakis: M.: Medicina, 1998.
12. Fisiologia umana. Sotto. ed. Schmidt R. e Tevs GT 1. M.: Mir, 1996.
SEZIONE 2. BIOFISICA DELLE CELLULE E DEGLI ORGANI
2. 1. Attività elettrica degli organi.
Controlla le domande, i compiti, i compiti per i seminari
1. Qual è il principio di un generatore equivalente? Fornisci esempi dell'uso di questo principio.
2. Perché il problema inverso dell'elettrocardiografia è un compito diagnostico e non diretto?
3. Qual è il meccanismo per la formazione di una mappa dei potenziali elettrici sulla superficie del corpo umano?
4. Perché è necessario registrare almeno 3 derivazioni ECG e non, ad esempio, una?
Test di monitoraggio del modello
2.1.1. Quando si modella l'ECG, si presume che l'ambiente circostante i dipoli
un. omogeneo a, eterogeneo
b. isotropo b", anisotropo
in. limitato in", infinito
1. abc 2. a"b"c" 3.ab"c 4.abc"
2.1.2. Qual è la ragione dei cambiamenti nell'ampiezza e nella direzione del vettore elettrico integrale del cuore durante il ciclo del suo lavoro?
contrazione dei ventricoli del cuore
copertura successiva dell'onda di eccitazione di varie strutture del cuore
attività metabolica dei cardiomiociti
rallentando la velocità dell'onda nel nodo atrioventricolare
2.1.3. Perché le ampiezze degli stessi denti ECG contemporaneamente in diverse derivazioni non sono le stesse?
per conduttori diversi, il valore del vettore elettrico integrale E _
in diverse derivazioni, la rotazione del vettore E è diversa
le proiezioni del vettore E su derivazioni diverse non sono le stesse
ogni derivazione ha il proprio vettore E
2.1.4. Il vettore elettrico integrale del cuore E descrive gli anelli P, QRS, T:
1.orizzontale
2.nel piano della superficie del torace
Z.in spazio volumetrico XYZ
4. nel piano che collega i punti della mano destra, della mano sinistra e della gamba sinistra
2.1.5 Differenze potenziali registrate
1. ag 2. essere 3. vg 4. dv
2.2. Processi di Autowave nei media attivi.
Controlla le domande, i compiti, i compiti per i seminari
Qual è la differenza fondamentale tra le onde automatiche nei mezzi attivi e le onde meccaniche nei mezzi elastici?
Perché un'onda automatica si propaga in un mezzo attivo senza smorzamento?
L'interferenza delle onde automatiche è osservata nei media attivi?
Da cosa dipendono i parametri dell'autowave nel mezzo attivo?
Il potenziale soglia per le cellule della regione miocardica è - 30 mV. Il potenziale transmembrana delle cellule in quest'area ad un certo punto ha raggiunto un valore di 40 mV. Un'onda di eccitazione può essere trasmessa attraverso quest'area del miocardio?
Test di monitoraggio del modello
2.2.1. L'onda di eccitazione (autowave), che si propaga attraverso il mezzo attivo (ad esempio attraverso la struttura del miocardio), non decade:
trasferendo energia da una cellula all'altra
rileverà il rilascio di energia immagazzinata da ciascuna cellula
come risultato del trasferimento di energia meccanica della contrazione miocardica
come risultato dell'utilizzo dell'energia del campo elettrico
2.2.2 La lunghezza d'onda di eccitazione nel mezzo attivo dipende da:
un. ampiezze del potenziale d'azione del cardiomiocita
b. sulla velocità di propagazione dell'onda nel miocardio
in. sulla frequenza del polso del pacemaker
g. dalla durata del periodo refrattario dell'eccitato
cellule1. ab 2. bg 3. cg 4. ag
2.2.3 La circolazione di un'autoonda (rientro) di durata X in un anello con un perimetro / può avvenire alla condizione:
2.2.4. Se in un mezzo attivo disomogeneo sono presenti zone con refrattarietà R 1 e R 2 (R 2 > R:) e gli impulsi del pacemaker seguono con un periodo T, la trasformazione del ritmo può verificarsi a condizione:
1. T
R 1 3.T = R 2 -R 1 2.3. Biofisica della contrazione muscolare.
Controlla le domande, i compiti, i compiti per i seminari
Perché la contrazione isometrica ha una diversa forma di dipendenza F(t) a diverse lunghezze muscolari iniziali?
È possibile determinare il carico massimo che un muscolo può sostenere dalla curva V(P) Hill?
L'efficienza della contrazione muscolare aumenta con l'aumento della generazione di calore da parte di quel muscolo?
Quali sono le differenze tra l'accoppiamento elettromeccanico nei cardiomiociti e il muscolo scheletrico?
Test di monitoraggio del modello
2.3.1. Durante la contrazione muscolare:
un. i filamenti di actina scivolano nel sarcomero lungo la miosina
b. la miosina si comprime come una molla
in. i ponti si attaccano ai siti attivi di actina
d. ponti aperti
1. av 2. bg 3. bv 4. ag
2.3.2. La forza di contrazione generata da un muscolo è determinata da:
1. lunghezza del filo attiva
2 cambio di forza generato da un ponte
il numero di ponti chiusi contemporaneamente
elasticità del filamento di miosina
2.3.3. La dipendenza della velocità v di una singola contrazione muscolare dal carico P ha la forma:
2.3.4 L'accoppiamento elettromeccanico è determinato dalla seguente catena di eventi:
un. rilascio di ioni Ca 2+ sulle miofibrille
b. eccitazione della membrana cellulare
in. trasporto attivo di ioni Ca 2+ nel reticolo sarcoplasmatico
d. chiusura dei ponti per actina centri attivi
e. scivolamento dell'actina nel sarcomero
1. Fisiologia umana. T. 2. M.: Mir, 1996.
2. Vasiliev VA, Romanovsky Yu.N., Yakhno V.G. Processi di onde automatiche. Mosca: Nauka, 1987.
3.Ivanitsky GR, Krinsky VI, Selkov E.E. Biofisica matematica della cellula. Mosca: Nauka, 1978.
4. Chernysh AM Biomeccanica delle disomogeneità del muscolo cardiaco. Mosca: Nauka, 1993.
5. Bendol J. Muscoli, molecole e movimento. M.: Mir, 1989.
SEZIONE 3. BIOFISICA DEI SISTEMI COMPLESSI
3.1. Modellazione dei processi biofisici.
Controlla le domande, i compiti, i compiti per i seminari
Quanto tempo dopo l'iniezione rimarrà nel sangue il 10% della massa iniziale del farmaco se la costante di escrezione k = 0,3 (1/ora)?
Le costanti di escrezione di due diversi farmaci differiscono di un fattore due. Disegna grafici qualitativi dei cambiamenti nella massa del farmaco nel sangue durante le iniezioni per questi due casi. Quante volte le velocità di escrezione differiscono a t = O?
Qualche tempo dopo che al paziente è stata applicata una flebo (quando la concentrazione del farmaco ha raggiunto il livello stazionario), gli è stata somministrata un'iniezione. Disegna un grafico qualitativo della variazione della massa del farmaco nel tempo.
Test di monitoraggio del modello
3.1.1. Il modello predatore-preda mostra che le popolazioni di predatori e prede compiono oscillazioni armoniche. Le frequenze e le fasi di queste oscillazioni sono le stesse?
un. le frequenze sono le stesse le fasi sono le stesse
b. le frequenze sono diverse d. le fasi sono diverse
1. av 2. bv 3. ag 4. bg
3.1.2. Quale modello è adeguato per gli studi sull'elettrogenesi nelle cellule?
1. liposoma 2. membrana lipidica a doppio strato
3. assone calamaro 4. modello Frank
3.2. Biofisica del sistema circolatorio.
Controlla le domande, i compiti, i compiti per i seminari
Complesso didattico e metodologico sulla disciplina "regolazione statale dell'economia"
Complesso formativo e metodologico... educativo-metodicocomplessoSudisciplina"REGOLAMENTO STATO DELL'ECONOMIA" UFA -2007 Regolamentazione statale dell'economia: educativo-metodicocomplesso... scienze economiche educativo-metodicocomplessoSudisciplina"Stato...
Complesso didattico e metodologico nella disciplina della formazione professionale generale "teoria e metodi di insegnamento della biologia" specialità "050102 65 - biologia"
Complesso formativo e metodologicoeducativo-metodicocomplessoSuComplesso formativo e metodologico
... __________________________________________________________ (Nome e cognome.) educativo-metodicocomplessoSudisciplina Organizzazione di computer e ... Samme G.V. educativo-metodicocomplessoSudisciplina Organizzazione di computer e sistemi (nome discipline) compilato...
Il raggio della nave si è dimezzato. Quante volte cambierà la velocità del flusso sanguigno volumetrico con una caduta di pressione costante?
Calcolare la pressione sanguigna a una distanza di 5 cm dall'inizio del vaso, se all'inizio del vaso la pressione è 10 4 Pa, il suo raggio è 1 mm, la viscosità del sangue è 0,005 Pa s, la velocità lineare del il sangue è 20 cm/s.
Quante volte cambierà il tasso di caduta di pressione all'inizio della diastole se la resistenza idraulica dei piccoli vasi aumenta del 20%?
Quante volte la resistenza idraulica di una sezione aortica (raggio aortico 1,25 cm) è inferiore alla resistenza idraulica di una sezione arteriosa della stessa lunghezza (raggio dell'arteria 2,5 mm)? La viscosità del sangue nell'arteria è 0,9 della viscosità del sangue nell'aorta.
Quante volte la pressione sanguigna dovrebbe aumentare all'inizio di un grande vaso in modo che quando il suo lume si restringe del 30%, la pressione all'uscita del vaso e la portata volumetrica del sangue rimangono le stesse? In assenza di costrizione, la caduta di pressione nel vaso è 0,2 della pressione all'inizio del vaso.
in Biologia, Candidato di Scienze Pediatriche, Professore Associato Osipova I.V. metodico istruzioni allo studente Su studiando disciplineDisciplina"Metodologia dell'extracurriculare...
Sangue ed eritrociti. Continuiamo a pubblicare materiali sul sangue.
Che aspetto ha un eritrocita? In normali condizioni fisiologiche nel flusso sanguigno, gli eritrociti hanno una forma biconcava con ispessimento uniforme lungo i bordi e con una parte centrale più chiara - pelle.
In uno studio ottico-ottico, un normale eritrocita macchiato di routine con coloranti acidi ha la forma di un disco con un diametro di 6,9-7,7 e fino a 9,0 micron. A seconda delle dimensioni, gli eritrociti si dividono in micro e macrociti, ma la maggior parte di essi è rappresentata da normociti/discociti.
Proprietà morfofunzionali di un erythrocyte
Un eritrocita è una cellula biconcava priva di nuclei con un volume medio di 90,0 µm 3 e un'area di 142 µm 2 . Il suo spessore massimo è 2,4 µm, il minimo è 1 µm.
Nella preparazione essiccata, la dimensione media di un eritrocita è di 7,55 μm; Il 95% della sua sostanza secca ricade sull'emoglobina proteica contenente ferro e solo il 5% sulla quota di altre sostanze (altre proteine e lipidi). Tali cellule rappresentano la maggioranza assoluta - oltre l'85% - degli eritrociti umani sani.
Le forme nucleari di un germe eritrocitario si distinguono facilmente dalla maggior parte delle cellule della serie dei leucociti per l'assenza di granuli nel loro citoplasma (gli errori sono possibili solo quando si identificano i blasti). Gli eritroblasti sono caratterizzati da una cromatina nucleare più granulare e densa.
La cavità centrale (pellor) del disco eritrocitario rappresenta dal 35 al 55% della sua superficie e, sulla sezione trasversale, l'eritrocita ha la forma di una ciambella, che, da un lato, garantisce la conservazione dell'emoglobina e, da un lato, dall'altro, permette all'eritrocita di passare anche attraverso i capillari più sottili. I modelli attualmente disponibili della struttura degli eritrociti corrispondono al concetto delle proprietà specifiche di questa cellula, in particolare della sua membrana, che, nonostante la sua sensibilità alla pressione deformante, fornisce resistenza alla flessione e un aumento della superficie totale.
I dati della letteratura indicano che le dimensioni e la deformabilità della membrana eritrocitaria sono le loro caratteristiche più importanti, che sono associate al normale funzionamento di queste cellule, inclusa l'elevata capacità di migrazione, la partecipazione ai processi metabolici (principalmente allo scambio di ossigeno).
I cambiamenti nelle proprietà microelastometriche degli eritrociti e la "trasformazione" dei discociti in altre forme morfologiche possono essere causati da vari agenti. Pertanto, la comparsa di escrescenze superficiali porta a una diminuzione dell'elasticità della membrana, che può essere dovuta a forze opposte che sorgono proprio nel processo di deformazione degli eritrociti; la deformazione aumenta con una diminuzione della concentrazione di ATP nelle cellule.
Se l'integrità della membrana cellulare viene violata, l'eritrocita perde la sua forma caratteristica e si trasforma in uno sferoplasto, che a sua volta viene emolizzato. La struttura della membrana eritrocitaria (discocita) è la stessa in tutto; e nonostante si possano manifestare depressioni e rigonfiamenti nelle sue varie parti, variazioni della pressione intra o extracellulare con una diffusione del ± 15% non provocano raggrinzimento dell'intera cellula, poiché presenta un notevole margine di "antideformabilità" . La membrana eritrocitaria ha un'elasticità sufficiente per resistere all'influenza di vari fattori che si verificano durante la circolazione dell'eritrocita attraverso il flusso sanguigno.
La composizione della membrana eritrocitaria comprende: fosfolipidi (36,3%), sfingomieline (29,6%), colesterolo (22,2%) e glicolipidi (11,9%). I primi due elementi sono molecole anfifiliche in un mezzo acquoso, che formano un caratteristico doppio strato lipidico, che è anche permeato da molecole proteiche integrali associate all'interno dell'eritrocita con il suo citoscheletro.
I lipidi di membrana sono allo stato liquido, hanno una bassa viscosità (solo 10-100 volte la viscosità dell'acqua). Sulla superficie esterna della membrana si trovano lipidi, acido sialico, oligosaccaridi antigenici, proteine adsorbite; la superficie interna della membrana è rappresentata da enzimi glicolitici, sodio e calcio, ATPasi, glicoproteine ed emoglobina.
Il doppio strato lipidico della membrana svolge tre funzioni: la funzione di barriera per ioni e molecole, la base strutturale per il funzionamento di recettori ed enzimi (proteine, glicoproteine, glicolipidi) e meccanica. Nell'attuazione di una funzione respiratoria specializzata - il trasferimento di ossigeno o anidride carbonica - il ruolo principale è svolto dalle proteine di membrana "incorporate" nel doppio strato lipidico. Gli eritrociti maturi non sono in grado di sintetizzare acidi nucleici ed emoglobina; sono caratterizzati da un basso livello di metabolismo, che assicura un periodo di vita sufficientemente lungo di queste cellule (120 giorni).
Con l'invecchiamento dell'eritrocita, la sua superficie diminuisce, mentre il contenuto di emoglobina rimane invariato. È stato stabilito che nell'età "matura", gli eritrociti mantengono a lungo una composizione chimica costante, ma con l'invecchiamento delle cellule, il contenuto di sostanze chimiche in essi diminuisce gradualmente. Il citoscheletro eritrocitario è formato e controllato da "famiglie" di proteine multigene e associate alla membrana che organizzano domini di membrana specializzati che mantengono la funzione e la forma di questa cellula altamente specializzata.
Potenziale elettrico dell'eritrocita
La membrana eritrocitaria contiene il 50% di proteine, fino al 45% di lipidi e fino al 10% di carboidrati. Sulla superficie delle cellule intatte, la distribuzione "a rete" delle cariche è determinata da una glicoproteina contenente acido sialico (neutramico), che determina fino al 62% della carica negativa superficiale della cellula.
Si ritiene che ogni carica elettrica corrisponda a 1 molecola di questo acido. La perdita di acido sialico da parte della superficie degli eritrociti porta ad una diminuzione della sua mobilità elettroforetica (EPM) e alla soppressione del trasporto cationico. Di conseguenza, sulla superficie cellulare è presente un "mosaico" di cariche, determinato da gruppi cationici e anionici, il cui rapporto determina la carica elettrica totale degli eritrociti.
Per mantenere uno stato ottimale di omeostasi, le cellule del sangue devono avere una carica stabile. L'elevata stabilità dell'EFP è assicurata da un sottile meccanismo della sua regolazione: l'equilibrio dei processi di perossidazione lipidica (LPO) nelle membrane degli eritrociti e l'effetto protettivo del sistema antiossidante.
È stato empiricamente stabilito che i recettori per gli anticorpi si trovano sulla membrana degli eritrociti e la presenza anche di una piccola quantità di essi sulla superficie può interrompere le normali funzioni fisiologiche nel corpo e modificare l'EFP degli eritrociti. Ciò può influenzare il livello di emoglobina in quest'ultimo, poiché il contenuto di emoglobina ed EFP è strettamente coordinato.
Va anche tenuto conto del fatto che in caso di effetti estremi di fattori negativi sul corpo, i prodotti della perossidazione lipidica influenzano le proprietà elettrocinetiche degli eritrociti. A sua volta, questo si riflette nella velocità dei processi di perossido nelle loro membrane.
Grazie alla repulsione elettrostatica ("diffusione" secondo Chizhevsky) delle cellule eritrocitarie con carica simile, queste ultime si muovono liberamente attraverso i vasi sanguigni, svolgendo la loro funzione di trasporto dell'ossigeno. Pertanto, una violazione della stabilità della carica può essere considerata un indicatore integrale di cambiamenti patologici nel corpo.
2. Qual è la distanza sulla superficie della membrana eritrocitaria che una molecola di fosfolipidi percorre in 1 secondo a causa della diffusione laterale? Prendi il coefficiente di diffusione laterale pari a 10–12 m2/s. Confronta con la circonferenza di un eritrocita con un diametro di 8 µm.
3. Durante la transizione di fase dei fosfolipidi di membrana dallo stato di cristalli liquidi al gel, lo spessore del doppio strato cambia. Come cambierà la capacità della membrana in questo caso? Come cambierà l'intensità del campo elettrico nella membrana?
4. Come cambierà la capacità elettrica della membrana (specifica) durante il suo passaggio dallo stato di cristalli liquidi al gel, se noto
5. Calcolare il tempo di vita insediata e la frequenza dei salti da uno strato di membrana all'altro membrane lipidiche del reticolo sarcoplasmatico, se il coefficiente di diffusione laterale D=12 µm 2 /s, l'area occupata da una molecola di fosfolipide A= 0,7 nm 2.
6. Calcolare il coefficiente di permeabilità per la sostanza il cui flusso attraverso la membrana è mol/m. La concentrazione di una sostanza all'interno della cellula e all'esterno - mol / l.
7. Quante volte la concentrazione intracellulare di ioni potassio deve superare quella esterna in modo che il potenziale di riposo sia 91 mV. Calcola la temperatura della cella.
8. Calcolare il coefficiente di distribuzione K per una sostanza se, con uno spessore della membrana di 10 nm, il coefficiente di diffusione è 7,2 * 10 cm e il coefficiente di permeabilità è 14 cm / s.
9. La differenza nella concentrazione di molecole di sostanza sulla membrana di una determinata cellula è 48 mmol / l, il coefficiente di distribuzione tra la membrana e l'ambiente è 30, il coefficiente di diffusione è 1,5 * 10, la densità del flusso è 25 mol / m. Calcola lo spessore di questa membrana.
10. Trova il coefficiente di permeabilità della membrana plasmatica di Mycoplasma, per la formammide, se, con una differenza di concentrazione di questa sostanza all'interno e all'esterno della membrana, pari a 0,5 * 10, la sua densità di flusso attraverso la membrana è 8 * 10 cm / s .
17. Il raggio critico di un poro lipidico in una membrana dipende dalla tensione del bordo del poro , dalla tensione superficiale della membrana e dal potenziale di membrana . Derivare una formula per il raggio dei pori critico. Calcolare il raggio dei pori critico in assenza di un potenziale di membrana. Prendi la tensione del bordo del poro 10 - 11 N, la tensione superficiale del doppio strato lipidico 0,3 mN/m.18. Durante la transizione di fase dei fosfolipidi di membrana dallo stato di cristalli liquidi al gel, lo spessore del doppio strato cambia. Come cambierà la capacità della membrana in questo caso? Come cambierà l'intensità del campo elettrico nella membrana?
19. Durante la transizione di fase dei fosfolipidi di membrana dallo stato di cristalli liquidi al gel, lo spessore del doppio strato cambia. Come cambierà la capacità della membrana in questo caso? Come cambierà l'intensità del campo elettrico nella membrana?20. Come cambierà la capacità elettrica della membrana (specifica) durante il suo passaggio dallo stato di cristalli liquidi al gel, se è noto che nello stato di cristalli liquidi lo spessore dello strato idrofobico è di 3,9 nm e nel gel stato - 4,7 nm. Costante dielettrica dei lipidi 2.
21. La pressione osmotica del sangue umano è 0,77 MPa. Quante moli di sale NaCl dovrebbe contenere una soluzione salina isotonica in 200 ml di acqua ad una temperatura di 37°C?
22. Quando lo spettro NMR dello stesso campione è stato registrato nuovamente, la temperatura è cambiata, le righe dello spettro sono diventate più strette. In che direzione è cambiata la temperatura: diminuita o aumentata?
23. Trova la lunghezza dell'onda elettromagnetica alla quale l'EPR si verifica in un campo magnetico con un'induzione magnetica di 0,3 T. Prendi il fattore Lande uguale a due.
24. Una corrente scorre lungo un contorno con un raggio di 0,5 m. Trova l'intensità di questa corrente se è noto che il momento magnetico del circuito B.
26. Determinare la potenza di radiazione termica di una persona nuda con S = 1 m 2 della superficie corporea, se la temperatura della pelle è t 1 = 30 0 C, l'ambiente è t 2 = 20 0 C. Coefficiente di assorbimento cutaneo k = 0,9
27. L'intensità della radiazione del corpo umano è aumentata del 2,62%. Di quale percentuale è aumentata la temperatura?
28. Determinare la lunghezza d'onda corrispondente alla massima densità spettrale della luminosità energetica del corpo umano, considerandolo un corpo grigio. Temperatura cutanea t=30 0 C.
29. Determinare l'indice di assorbimento molare naturale delle sostanze se, alla sua concentrazione in una soluzione di c = 0,03 mol / l, la densità ottica della soluzione è D = 1. Lunghezza cuvetta l= 2 cm.
30. Osservando al microscopio il movimento dei globuli rossi in un capillare, è possibile misurare la velocità del flusso sanguigno (). La velocità media del flusso sanguigno nell'aorta è . Sulla base di questi dati, determinare quante volte la somma di tutti i capillari funzionanti è maggiore della sezione trasversale dell'aorta.
31. Calcolare il limite di risoluzione z di un microscopio elettronico, se la tensione di accelerazione in esso è U=100 kV, l'angolo di apertura è u=10 -2 rad.
32. Calcolare la viscosità del sangue a ematocrito normale (c=45%) se la viscosità plasmatica è
33. Calcolare il volume minuto massimo Qmax di sangue al quale il flusso sanguigno nell'aorta rimane laminare. Diametro aortico d=2 cm, viscosità del sangue, densità, numero di Reynolds critico Re kr =2000.
34. La velocità di propagazione dell'onda del polso attraverso l'arteria è v=10 m/s. Determinare il modulo di elasticità E dell'arteria, se lo spessore della sua parete h=0,7 mm, diametro interno d=8 mm, densità del sangue
35. Il raggio dell'aorta è 1,0 cm; la velocità del flusso sanguigno nell'aorta è di 30 cm/s. Qual è la velocità del flusso sanguigno nei capillari se l'area della sezione trasversale totale dei capillari è di 2000 cm 2 . (Il diametro di ciascun capillare è preso come , e il numero di capillari è più di un milione).
36. In medicina, l'effetto Doppler viene utilizzato per determinare la velocità di movimento delle singole strutture biologiche (ad esempio sangue, valvole cardiache). In che modo la variazione della frequenza di un segnale ultrasonico riflesso da un oggetto in movimento è correlata alla sua velocità?
37. Una forza F = 10 N viene applicata al pistone di una siringa posizionata orizzontalmente Determinare la velocità v del deflusso del farmaco dall'ago della siringa se la densità del farmaco è , il diametro del pistone è d = 7 mm e la sua area è molto più grande dell'area della sezione trasversale dell'ago.
38. Con quale velocità v galleggia una bolla d'aria con un diametro di d = 4 mm in un recipiente pieno di glicerina? La viscosità cinematica della glicerina, la sua densità è molto maggiore di quella dell'aria.
39. In alcune malattie, il numero critico di Reynolds nei vasi diventa uguale a 1160. Trova la velocità del movimento del sangue alla quale è possibile il passaggio dal flusso laminare a quello turbolento in un vaso con un diametro di 2 mm.
40. Il livello del volume del suono è 120 phon, e una conversazione tranquilla - alla stessa distanza - 41 phon. Determina il rapporto delle intensità.
42. Intensità sonora 10-2 W/m2. Trovare la pressione sonora se la resistenza acustica del mezzo (aria) è di 420 kg/m2s.
43. Determinare il valore di ampiezza della pressione sonora per un tono puro con una frequenza di 1000 Hz, al quale la membrana timpanica può rompersi se la rottura si verifica a un livello di volume L E = 160 phon. (La risposta è espressa in pascal e in atm.)
44. Il riscaldatore elettrico nell'impianto per il trattamento termico delle materie prime medicinali evapora 1 litro d'acqua in 10 minuti, viscoso a una temperatura di 20 0 C. Determinare la lunghezza del filo di nichelcromo con una sezione trasversale di 0,5 mm 2, dato che l'impianto è alimentato a 120 V e la sua efficienza è dell'80% ?
45. L'intensità della luce che passa attraverso una soluzione di aspirina in un solvente non assorbente è ridotta di un fattore tre a causa dell'assorbimento. La concentrazione di molecole di aspirina n 0 =10 20 m -3 . Il percorso della luce nella soluzione = 150 mm. Determinare la sezione trasversale di assorbimento efficace dell'aspirina.
46. Determina la differenza di fase nell'onda del polso tra due punti dell'arteria posti a distanza l'uno dall'altro, considerando la velocità dell'onda del polso pari a v = 10 m / s, le oscillazioni del cuore sono armoniche con una frequenza = 1,2 Hz.
49. Per riscaldare il tessuto muscolare, viene applicata una tensione agli elettrodi piatti con un'ampiezza U 0 \u003d 250 V e una frequenza \u003d 10 6 Hz. La resistenza attiva di questa sezione del circuito R=10 3 Ohm; capacità C= F. Determinare la quantità di calore rilasciata nel volume di tessuto tra gli elettrodi durante il periodo di oscillazione T e durante la procedura t=10 min.
50. La ionoforesi viene utilizzata per introdurre farmaci nel corpo umano. Determinare il numero di ioni ionizzati singolarmente della sostanza farmacologica somministrata al paziente nel tempo t= 10 min ad una densità di corrente di 0,05 mA/cm 2 da un elettrodo con un'area di S=5 cm 2
DOMANDE D'ESAME
membrane biologiche. Tipi di membrane biologiche e loro funzioni.
Tipi di lipidi di membrana e loro proprietà. Strutture lipidiche a doppio strato.
Colesterolo. Dinamica dei lipidi nella membrana. Transizioni di fase nella membrana.
proteine di membrana. Tipi e funzioni delle proteine di membrana.
La struttura delle membrane biologiche.
membrane artificiali. Liposomi.
Metodi per lo studio della struttura delle membrane.
Fenomeni capillari, loro significato in biologia e medicina. embolia gassosa.
Trasporto di sostanze attraverso membrane biologiche Vie di penetrazione di sostanze nella cellula.
Tipi di trasporto. semplice diffusione.
Trasporto di nonelettroliti attraverso membrane biologiche.
Meccanismi di base del trasporto passivo.
Trasporto ionico. Trasporto ionico di sostanze nei canali.
Meccanismi di permeabilità delle membrane biologiche. Struttura e funzioni di canali ionici e portanti. Meccanismi di elettrogenesi.
Trasporto attivo attraverso membrane biologiche.
Meccanismi molecolari dei potenziali elettrochimici delle membrane e propagazione di un impulso nervoso lungo una fibra eccitabile.
Il concetto di eccitabilità elettrica . Potenziali a riposo .
Metodi di misurazione del potenziale di membrana. Tecnologia dei microelettrodi.
potenziale d'azione . Il meccanismo di generazione e propagazione del potenziale d'azione.
Metodi per lo studio dei meccanismi molecolari dei potenziali elettromeccanici delle membrane.
Propagazione di un impulso nervoso lungo una fibra eccitabile.
Sensori di informazioni biomediche. Tipi di sensori.
Scopo e classificazione dei sensori, caratteristiche.
Fenomeni termoelettrici nei metalli e nei semiconduttori.
Taratura di sensori termici e determinazione della temperatura di una sostanza.
Elettrodi per la presa del segnale bioelettrico.
Correnti ioniche nel modello Hodgkin-Huxley.
Canali ionici nelle membrane cellulari. Struttura del canale ionico.
Il meccanismo di generazione del potenziale d'azione del cardiomiocita.
potenziali di membrana Il potenziale d'azione della cellula cardiaca.
Basi fisiche dell'elettrocardiografia. Il dispositivo, il principio di funzionamento dell'elettrocardiografo .. Approcci di base alla registrazione dell'ECG.
Registrazione ECG e principi di analisi.
Elettroencefalografia. Ritmi EEG di base. loro significato funzionale.
Registrazione dell'EEG e principi di analisi. prove funzionali.
I principali tipi di attività elettrica dei neuroni piramidali.
37. Livelli energetici delle molecole (energia elettronica, vibrazionale e rotazionale delle molecole).
38. Transizioni elettroniche nell'assorbimento della luce.
39. Spettri di assorbimento di molecole di alcuni composti biologicamente importanti.
40. Metodi per lo studio dei processi fotobiologici mediante spettri.
41. Dispositivo e principio di funzionamento degli spettrofotometri .
42. Lo studio dei metodi di ricerca spettrofotometrica per la determinazione della concentrazione di sostanze nei fluidi biologici.
43. Luminescenza dei sistemi biologici.
44. Luminescenza. Vari tipi di luminescenza.
45. Fotoluminescenza. La regola di Stokes.
46. Rendimento quantico di fluorescenza. Livello di tripletta e fosforescenza.
47. Analisi qualitativa e quantitativa fotoluminescente di oggetti biologici.
48. Microscopia fluorescente. Chemiluminescenza, meccanismo di generazione della chemiluminescenza
49. Fasi primarie dei processi fotobiologici.
50. Spettri di azione fotobiologica.
51. Studio di prodotti di reazioni fotobiochimiche primarie.
52. Ossidazione dei radicali liberi Reazioni fotochimiche primarie delle proteine.53. Trasformazione fotochimica del DNA.
54. Caratteristiche dell'azione della radiazione laser ad alta intensità sul DNA.
55. Fotoriattivazione e fotoprotezione.
56. Azione della luce ultravioletta sulle membrane biologiche.
57. Processi fotobiologici fotosensibilizzati.
58. Studio di oggetti biologici in microscopia.
59. Metodi speciali di microscopia di oggetti biologici
60. Sistema ottico di un microscopio, che costruisce l'immagine di un oggetto.
61. La formula per l'ingrandimento di un microscopio ottico.
62. Biofisica della contrazione muscolare . Modello a filo scorrevole.
63. Biomeccanica del muscolo. Equazione di collina.
64. Potenza di una singola contrazione. Simulazione della contrazione muscolare.
65. Interfaccia elettromeccanica
66. Sistema circolatorio (arterie, vene). Meccanismo di circolazione sanguigna
67. Movimento di sangue in grandi vasi.
68. Organizzazione del flusso sanguigno nei microvasi.
69. Movimento delle cellule del sangue nei capillari.
70. Fattori che determinano le proprietà reologiche del sangue.
71. Forme di orientamento di erythrocytes in capillari.
72. Modelli emodinamici del flusso sanguigno attraverso i vasi.
73. Modelli fisici e matematici generali del movimento del sangue nel flusso sanguigno.
74. Reografia di vari organi e tessuti . Metodi per lo studio della circolazione sanguigna.
75. Metodi di registrazione e principi di analisi della curva eografica. Reografia integrale e regionale.
76. Metodi di registrazione indiretta dello shock e dell'espulsione minuta. Reografia integrata al computer.
77. Basi fisiche dell'interazione del suono e dei tessuti biologici.
78. Classificazione dei dispositivi e dispositivi medici.
79. Forme di energia che vengono convertite in un trasduttore di misura.
80. Dispositivi medici a fini terapeutici.
81. Apparecchiature mediche elettroniche terapeutiche.
82. Metodi di terapia ad alta frequenza (HF, UHF, microonde, ecc.) e loro effetti biofisici.
83. Il dispositivo dell'apparecchio per terapia UHF e il suo principio di funzionamento.
84. Tecnica terapeutica basata sull'uso della corrente continua
85. Il dispositivo dell'apparato di zincatura e il suo principio di funzionamento. Basi fisiche della zincatura
86. Convertitori fotoelettrici.
87. Mezzi tecnici di base dell'introscopia medica.
88. Progettazioni di sensori e loro principali caratteristiche.
89. Dispositivi per misurare la funzione della respirazione esterna
90. Registrazione dei movimenti toracici durante i movimenti respiratori. Pneumografia, spirometria, spirografia.
Elenco delle abilità pratiche
per registrare EEG., RG
registrare l'ECG nelle derivazioni standard;
essere in grado di spiegare la genesi dei fenomeni ECG e le modalità per la loro rilevazione.
imparare a formulare una diagnosi elettrocardiografica.
registrare parametri fisici,
risultati di misurazione di processo utilizzando strumenti informatici;
misurare la concentrazione di sostanze utilizzando strumenti fotometrici.
risolvere il problema dell'abbinamento ottimale di un oggetto biologico e mezzi tecnici nella ricerca biomedica;
per scegliere i mezzi tecnici giusti per risolvere i problemi medici
1. Da ciò si è concluso che la membrana eritrocitaria è costituita da molecole lipidiche disposte in due strati.
Apparentemente, questa conclusione di Gorter e Grendel si è rivelata corretta solo per la reciproca compensazione degli errori, tuttavia, in termini storici, questo lavoro è stato di grande importanza, poiché da allora il concetto del doppio strato lipidico come base strutturale del biologico membrane è diventato dominante e di fatto si è rivelato corretto.
Il concetto di membrana lipidica bimolecolare è stato ulteriormente sviluppato nel modello Devson-Danielli del 1935, o modello "sandwich", in cui si presumeva che le proteine coprissero la superficie del doppio strato lipidico. Si trattava di un modello insolitamente riuscito e nei successivi 30 anni numerosi dati sperimentali, in particolare quelli ottenuti utilizzando la diffrazione dei raggi X e la microscopia elettronica, ne confermarono pienamente l'adeguatezza. Tuttavia, allo stesso tempo, si è scoperto che le membrane svolgono un'enorme varietà di funzioni e, per spiegare questo fenomeno, il modello originale di Devson-Danielli è stato ripetutamente modificato.
Il rapido progresso della membranologia, che ha portato alla formazione di concetti moderni, è stato ottenuto in gran parte grazie ai progressi nello studio delle proprietà delle proteine di membrana. Studi al microscopio elettronico utilizzando il metodo del freeze-shear hanno mostrato che le particelle globulari sono incorporate nelle membrane. Nel frattempo, i biochimici utilizzando detergenti sono riusciti a dissociare le membrane allo stato di "particelle" funzionalmente attive. I dati spettrali hanno indicato che le proteine di membrana sono caratterizzate da un alto contenuto di a-eliche e che probabilmente formano globuli piuttosto che essere distribuite come un monostrato sulla superficie del doppio strato lipidico. Le proprietà non polari delle proteine di membrana hanno suggerito la presenza di contatti idrofobici tra le proteine e la regione non polare interna del doppio strato lipidico. Allo stesso tempo, sono stati sviluppati metodi che hanno permesso di rivelare la fluidità del doppio strato lipidico. Singer e Nicholson hanno unito tutte queste idee per creare un modello di mosaico fluido. All'interno di questo modello, la membrana è rappresentata come un doppio strato fosfolipidico fluido, in cui sono immerse proteine che si diffondono liberamente. Il vecchio modello Devson-Danielli era statico e spiegava con successo i dati strutturali disponibili all'epoca, ottenuti con una risoluzione abbastanza bassa. Allo stesso tempo, dal 1970, molta attenzione è stata dedicata allo studio delle proprietà dinamiche e alla loro relazione con le funzioni di membrana. Negli ultimi anni anche il modello a mosaico fluido è stato modificato e questo processo continuerà. In particolare, è ormai chiaro che non tutte le proteine di membrana si diffondono liberamente nel doppio strato lipidico liquido. Ci sono dati sull'esistenza di domini j laterali nella membrana stessa. Anche il ruolo del citoscheletro è oggetto di studio approfondito. Sta diventando sempre più chiaro che alcune porzioni delle membrane sembrano differire nella struttura dal classico doppio strato lipidico. Tuttavia, nel prossimo futuro, il modello a mosaico fluido nelle sue varie modifiche servirà come base concettuale per molti studi sulle membrane.
3. Morfologia delle membraneDue metodi hanno svolto un ruolo importante nel chiarire la morfologia delle membrane: diffrazione dei raggi X e microscopia elettronica. È stato con il loro aiuto che è stata confermata la correttezza del modello a doppio strato. Tuttavia, va tenuto presente che entrambi questi metodi devono affrontare una serie di limitazioni nel chiarire un quadro dettagliato dell'organizzazione molecolare delle membrane.
3.1 Diffrazione dei raggi X
Nello studio di campioni cristallini altamente ordinati utilizzando il metodo di diffrazione dei raggi X, è possibile ottenere informazioni sulla struttura ad alta risoluzione. Nel caso di preparazioni mal ordinate, le possibilità di questo metodo sono limitate. Alcuni sistemi a membrana specializzati hanno già una struttura regolare e quindi possono essere studiati con metodi di diffrazione dei raggi X. Un esempio di questo tipo è la guaina mielinica delle fibre nervose periferiche; è una membrana che, avvolgendosi ripetutamente attorno all'assone, forma un sistema regolare di strutture di membrana concentriche. Gli studi di diffrazione dei raggi X sulla mielina, condotti negli anni '30, confermano l'adeguatezza del modello a doppio strato delle membrane. La stessa conclusione è tratta dallo studio del segmento esterno dei bastoncelli della retina dei vertebrati, che sono sistemi di membrana ordinati naturali, nonché sistemi ordinati artificialmente che si formano durante il collasso in condizioni di centrifugazione di vescicole di membrana ottenute da mitocondri ed eritrociti . In tutti questi casi è stata osservata una distribuzione simile della densità elettronica nella membrana, mostrata in Fig. 1.4
Per interpretare i dati di diffrazione dei raggi X, è necessario determinare non solo l'intensità delle riflessioni, ma anche le loro fasi. Nel caso di sistemi a membrana regolarmente impaccati, il problema è notevolmente semplificato, poiché questi sistemi sono costituiti da elementi ripetuti con simmetria centrale.
I dati ottenuti mostrano che la struttura di tutte le membrane è simile: hanno una regione interna idrofobica con una bassa densità di elettroni e due strati di gruppi polari con un'alta densità di elettroni. I dati di diffrazione dei raggi X ottenuti per diverse membrane differiscono solo leggermente, nonostante le grandi differenze nel loro contenuto proteico. Sebbene i dati sulla diffrazione dei raggi X forniscano alcune informazioni su come la maggior parte delle proteine di membrana si trovi nella membrana, in generale, il metodo di analisi della diffrazione dei raggi X non fornisce un quadro molecolare dettagliato.
Wilkins ed altri hanno notato nel 1971 che la diffrazione dei raggi X può essere usata anche per studiare le dispersioni acquose di membrane e fosfolipidi. In questo caso, le riflessioni generate dalle regioni polari su entrambi i lati del doppio strato consentono di trovare il suo spessore pari alla distanza tra le teste polari e la distanza tra queste catene può essere determinata dalle riflessioni generate da catene di idrocarburi ordinate . Anche in questo caso, preparazioni di membrana ottenute da diverse fonti hanno dato un pattern di diffrazione simile, che conferma l'universalità del modello a doppio strato.
L'impossibilità di ottenere un pattern molecolare dettagliato utilizzando il metodo di diffrazione limita l'applicazione di questo metodo allo studio delle membrane biologiche. Tuttavia, può essere molto utile nello studio dei sistemi acquosi lipidici ordinati.
3.2 Microscopia elettronica
La microscopia elettronica a trasmissione di sezioni sottili di mielina, e in effetti di tutte le altre membrane, rivela una caratteristica struttura a tre strati costituita da due bande ad alta densità di elettroni separate da uno spazio di circa 80 A. Questa immagine è ottenuta in larga misura come un risultato del trattamento di preparati con tetrossido di osmio, solitamente utilizzato in questo metodo. Robertson ha definito la struttura osservata "unitaria" per enfatizzare la sua universalità e, sebbene i meccanismi molecolari della colorazione della membrana con l'osmio siano sconosciuti, questa struttura è stata considerata una conferma della validità del modello a doppio strato della membrana. È chiaro, tuttavia, che le membrane possono essere influenzate negativamente durante la preparazione dei campioni per la microscopia elettronica a trasmissione. In particolare, è noto che il trattamento con tetrossido di osmio porta ad una significativa perdita di proteine dalla membrana eritrocitaria. E sebbene la struttura a tre strati osservata in questo caso rifletta in una certa misura l'organizzazione delle membrane a doppio strato, con questo metodo non è possibile ottenere informazioni più dettagliate sulla localizzazione delle proteine.
Alcune informazioni sulla disposizione delle proteine di membrana sono state fornite da nuovi metodi, che ora sono diventati "classici": i metodi di congelamento-clivaggio e congelamento-incisione. In questi casi i preparati vengono congelati velocemente senza esporli ad effetti dannosi, come quando si ottengono sezioni sottili. Il processo di preparazione del farmaco comprende le seguenti operazioni.
Dopo il congelamento, il campione, che è una sospensione di cellule o membrane, viene tagliato con un coltello a bassa temperatura in alto vuoto. Le forze generate durante la scheggiatura portano alla formazione di un taglio che attraversa il campione. Si è scoperto che quando il piano di taglio passa attraverso la membrana, quest'ultima si divide principalmente lungo la sua regione centrale e si divide in due metà. Di conseguenza, la regione interna della membrana è esposta sui piani di scissione formati.
Se necessario, il campione viene sottoposto ad incisione: la consueta sublimazione del ghiaccio viene eseguita sotto vuoto. Ciò consente una migliore visualizzazione delle strutture superficiali delle membrane cellulari.
Successivamente, si ottiene una cosiddetta replica dalla superficie esposta. È questa replica che viene studiata al microscopio elettronico. Per ottenere una replica, il platino viene prima depositato sul campione con un angolo di circa 45° in modo da rivelare le caratteristiche topologiche della preparazione. Quindi alla replica in platino viene data resistenza meccanica applicando uno strato di carbonio su di essa. Dopodiché, la preparazione viene scongelata, la replica galleggia e viene catturata usando una rete speciale.
Le strutture più caratteristiche osservate nello studio delle membrane con il metodo del freeze-clivage sono numerose particelle intramembrana con un diametro da 80 a 100 Å, che giacciono nel piano di scissione della membrana. Di solito si trovano in modo casuale, ma a volte formano gruppi. Numerosi studi hanno dimostrato che queste particelle sono probabilmente proteine di membrana. Curiosamente, la microscopia elettronica di sezioni sottili non rivela tali strutture. Le repliche ottenute dalle due metà della membrana divisa non sono sempre topologicamente complementari. Ciò significa che alcune particelle sono legate solo a una delle metà della membrana. I dati sulla scissione del congelamento sono stati ampiamente utilizzati da Singer e Nicholson nello sviluppo del modello a mosaico fluido delle membrane, poiché hanno dimostrato in modo convincente che le proteine globulari si trovano non solo sulla superficie della membrana, ma anche all'interno del doppio strato.
La Figura 1.6 mostra una micrografia elettronica di una preparazione di proteoliposomi ricostruiti da fosfatidilcolina d'uovo e una preparazione non frazionata della proteina di banda 3 da una membrana di eritrociti umani; La preparazione è stata ottenuta con il metodo di congelamento-climatura.
La proteina della banda 3 è la principale componente proteica della membrana degli eritrociti ed è nota per il trasporto di anioni. Se le vescicole fosfolipidiche non contengono questa proteina, le preparazioni di chip congelate risultanti hanno una superficie liscia.
Dopo l'incorporazione della proteina della banda 3 nelle vescicole fosfolipidiche, sulle fessure compaiono particelle intramembrana, che sono praticamente indistinguibili dalle particelle osservate nelle membrane degli eritrociti. Inoltre, a pH 5,5, le particelle viste nella membrana eritrocitaria si aggregano, e questa aggregazione avviene come risultato dell'interazione della proteina di banda 3 con altre due proteine, spettrina e actina.
Questi ultimi sono componenti del citoscheletro situato sulla superficie interna della membrana eritrocitaria. Il sistema ricostruito costituito dalla proteina della banda 3 e dalla fosfatidilcolina si comporta in modo simile, con aggregazione di particelle osservata in presenza di spettrina e actina a pH 5,5, ma non a pH 7,6.
Questi dati hanno ulteriormente rafforzato il concetto di proteine di membrana come particelle globulari che si muovono liberamente nel piano della membrana. È interessante notare che le microfotografie statiche di preparati ottenuti con il metodo del freeze-chipping hanno aiutato i ricercatori a studiare le proprietà dinamiche delle membrane. Come vedremo, ci sono molte proteine nelle membrane che non possono nuotare liberamente nel mare lipidico.
4. Isolamento delle membraneNegli ultimi tre decenni è diventato sempre più chiaro che la stragrande maggioranza delle funzioni cellulari viene svolta con il coinvolgimento diretto delle membrane.
Sia le cellule vegetali che quelle animali sono divise in compartimenti e molti organelli citoplasmatici, come mostrato nella Sezione 1.1, sono di natura membranale.
Oltre agli organelli caratteristici della maggior parte delle cellule, esistono anche sistemi di membrane specializzate, come il reticolo sarcoplasmatico delle cellule muscolari, la guaina mielinica delle fibre nervose periferiche, le membrane tilacoidi dei cloroplasti e le membrane dei dischi nei bastoncelli retinici. Anche gli organismi procarioti hanno membrane, sebbene non così sviluppate come quelle eucariotiche.
I batteri Gram-positivi, come Bacillus subtilis, hanno solo una membrana citoplasmatica, mentre i batteri Gram-negativi, come Escherichia coli, ne hanno anche una esterna situata sopra una sottile parete cellulare del peptidoglicano.
Alcuni organelli specializzati sono stati trovati anche nelle cellule procariotiche. Alcuni virus patogeni per gli animali, come i virus con involucro, hanno una vera membrana e tali membrane si sono rivelate estremamente interessanti da studiare.
Lo studio delle membrane, di regola, è associato alla loro purificazione e ogni tipo di membrana è caratterizzato dalle proprie condizioni per l'isolamento preparativo.
Quindi, se devi studiare la membrana plasmatica di qualsiasi cellula, devi prima isolare queste cellule dal tessuto. Devono quindi essere selezionate le condizioni ottimali per distruggere le cellule e separare le membrane di interesse da altri componenti cellulari. I criteri di purezza delle membrane isolate meritano un'attenzione particolare.
4.1 Distruzione di cellule
È auspicabile scegliere una tecnica che distrugga efficacemente le cellule stesse mantenendo la struttura delle membrane da isolare. Per molte cellule animali, può essere utilizzata una procedura relativamente delicata come l'omogeneizzazione in Downs con pareti di vetro o omogeneizzatori Potter-Elveheim con un pestello in teflon. In questo caso, le cellule vengono distrutte a causa delle forze di taglio che si verificano quando la sospensione viene forzata attraverso uno stretto spazio tra il pestello in teflon e la parete di vetro dell'omogeneizzatore. Con questo trattamento, la membrana plasmatica "si rompe" e i legami tra i vari organelli vengono distrutti mantenendo l'integrità degli organelli stessi. Utilizzando questa procedura, le regioni specializzate della membrana plasmatica possono anche essere separate l'una dall'altra, ad esempio le regioni basolaterali o apicali della membrana delle cellule epiteliali. È desiderabile operare in condizioni in cui viene mantenuta l'integrità degli organelli per ridurre al minimo la possibilità di rilascio di enzimi idrolitici e per facilitare le successive operazioni di separazione della membrana.
Per la distruzione delle cellule con una parete sono necessari metodi più rigorosi. A volte, prima che le cellule vengano distrutte, vengono trattate con enzimi che scompongono i componenti della parete cellulare per facilitarne la successiva distruzione. Ad esempio, il trattamento con tampone Tris-EDTA e lisozima viene utilizzato per distruggere le cellule di E. coli. Tecniche più rigorose includono lo sfregamento delle cellule, la sonicazione e l'estrusione. La molatura viene solitamente eseguita in presenza di vari materiali abrasivi: sabbia, allumina o perle di vetro. Piccoli volumi di materiale possono essere macinati in un mortaio e pestello, ma per volumi maggiori devono essere utilizzati dispositivi meccanici speciali. Le cellule batteriche vengono spesso distrutte utilizzando gli ultrasuoni. Si ritiene che in questo caso la distruzione avvenga sotto l'azione delle forze di taglio risultanti dalla cavitazione. Le stesse forze si verificano quando una sospensione cellulare viene forzata attraverso un piccolo foro, ad esempio quando le cellule vengono distrutte utilizzando una pressa francese. Esistono molte varietà di questi metodi e la loro scelta dipende dalle caratteristiche del sistema di membrane che si intende studiare.
Va notato che i frammenti di membrana ottenuti durante la distruzione cellulare di solito formano spontaneamente vescicole. Un esempio è:
1) microsomi derivati dalla membrana plasmatica, dal reticolo endoplasmatico o da sistemi specializzati come la membrana sarcoplasmatica;
2) particelle subcondriali dalla membrana mitocondriale interna;
3) sinaptosomi formati quando le terminazioni nervose vengono strappate nell'area dei contatti sinaptici;
4) vescicole della membrana batterica formate dalla membrana plasmatica di E. coli. Le vescicole sono formate anche da altri sistemi di membrane, ad esempio dalle membrane dell'apparato del Golgi. Le loro dimensioni nella maggior parte dei casi dipendono fortemente dal metodo di distruzione cellulare. Ciò è particolarmente importante, poiché la dimensione delle vescicole determina in gran parte la velocità della loro sedimentazione durante la centrifugazione e il loro comportamento nelle fasi successive di purificazione della membrana. Alcune membrane non formano vescicole, in particolare le membrane delle superfici laterali delle cellule animali a contatto tra loro. Quando tali cellule vengono distrutte, una coppia di frammenti di membrana adiacenti viene strappata, tenuta insieme dall'area di contatto. La presenza di tali contatti impedisce la chiusura di frammenti in vescicole, quindi le membrane vengono rilasciate sotto forma di piastre o strutture nastriformi.
Di grande importanza nella distruzione delle cellule è anche la corretta scelta del mezzo. Ad esempio, per mantenere chiusi gli organelli di membrana, si dovrebbe usare un mezzo che sia isoosmotico per il loro contenuto interno. Molto spesso, per questo viene utilizzata una soluzione di saccarosio a una concentrazione di 0,25-0,30 M. In alcuni casi, è meglio usare sorbitolo e mannitolo. Va notato che la conservazione dell'isotonicità svolge un ruolo importante anche nelle fasi successive dell'isolamento preparatorio degli organelli intatti.
4.2 Separazione delle membrane
Attualmente, la centrifugazione è più comunemente usata per separare le membrane. Le particelle di membrana possono essere classificate in base alla velocità di sedimentazione o alla densità di galleggiamento. Il primo metodo è chiamato centrifugazione zonale e la separazione avviene in base ai valori S, e il secondo metodo è la centrifugazione isopicnica e la separazione avviene in condizioni di equilibrio di densità. In pratica, di solito viene utilizzato un ibrido di questi due metodi. La Figura 1.7 mostra la posizione di alcune unità subcellulari sul piano delle coordinate "S-g".
L'ascissa mostra i coefficienti di sedimentazione delle particelle e l'ordinata mostra la densità.
Il principio della separazione per velocità di sedimentazione può essere facilmente compreso confrontando i valori S per diverse frazioni. Ad esempio, i nuclei hanno valori S relativamente alti, cioè la loro velocità di sedimentazione è molto più alta di quella della maggior parte degli altri organelli subcellulari. I nuclei possono essere pellettizzati selettivamente mediante centrifugazione dell'omogenato cellulare, lasciando tutti gli altri organelli nel surnatante. Allo stesso tempo, il reticolo endoplasmatico liscio e ruvido non può essere separato mediante centrifugazione zonale.
Le differenze nella loro densità sono spesso utilizzate per isolare diverse frazioni di membrana da un omogenato cellulare. A tale scopo viene eseguita la centrifugazione in un gradiente di densità. Molto spesso, il saccarosio viene utilizzato per creare un gradiente di densità, ma questo metodo presenta seri inconvenienti. Per ottenere la densità necessaria per separare le diverse frazioni di membrana, è necessario preparare soluzioni ad alta concentrazione di saccarosio, che abbiano un'elevata viscosità e siano anche ipertoniche. L'introduzione di organelli subcellulari in una soluzione ipertonica di saccarosio porta alla loro disidratazione e il successivo adeguamento della soluzione alle condizioni isotoniche è spesso accompagnato da lisi e danno agli organelli. Un altro problema è che molti organelli di membrana sono permeabili al saccarosio. Può anche portare alla distruzione osmotica degli organelli. La penetrazione del saccarosio negli organelli di membrana separabili può modificare la loro densità effettiva.
Tabella 1.1. Il tempo fisico utilizza sempre più altri media per creare un gradiente di densità. Alcuni di questi ambienti sono elencati nella Tabella 1.1
Per risolvere questi problemi, le ultime proprietà del gradiente multimediale.
1. Ficoll. Polimero idrofilo di saccarosio ad alto peso molecolare, che può essere utilizzato per ottenere soluzioni di C "Densità fino a 1,2 g / ml. Il suo principale vantaggio è la bassa pressione osmotica delle soluzioni rispetto alle soluzioni con una concentrazione equivalente di saccarosio. A causa di ciò, è possibile creare soluzioni isotoniche in tutto l'intervallo di concentrazioni grazie all'inclusione aggiuntiva di saccarosio o sali fisiologicamente accettabili nel mezzo. Gli svantaggi sono l'elevata viscosità delle soluzioni risultanti e la dipendenza significativamente non lineare della viscosità e dell'osmolarità da concentrazione.
2. Metrizamide. Glucobenzammide triiodosostituito Le soluzioni di metrizamide hanno una densità maggiore rispetto alle soluzioni di ficoll alle stesse concentrazioni. Il principale vantaggio delle soluzioni di metrizamide è la loro viscosità molto bassa, che consente una separazione più rapida.La soluzione di metrizamide al 35% ha un'osmolarità quasi fisiologica, in modo che la maggior parte delle operazioni durante la separazione delle membrane possono essere eseguite senza esporle a soluzioni ipertoniche. Il metrizoato di sodio è un composto correlato con proprietà simili alla metrizamide, con l'unica differenza che la sua soluzione è isotonica ad una concentrazione di circa il 20%. Il metrizoato di sodio viene utilizzato principalmente per l'isolamento delle cellule intatte. Naikodenz è anche un derivato dell'acido triiodobenzoico, ma ha tre catene laterali idrofile. Quando centrifugato, sviluppa rapidamente il proprio gradiente di densità; usato per isolare gli organelli subcellulari.
Percoll. Sospensione colloidale di gel di silice rivestito con polivinilpirrolidone. Questo rivestimento riduce l'effetto tossico del gel di silice. Il principale vantaggio del percoll è che non penetra nelle membrane biologiche e le sue soluzioni hanno bassa viscosità e bassa osmolarità. A causa della grande dimensione delle particelle, la centrifugazione della soluzione di Percoll a velocità moderate provoca la formazione di un gradiente di densità. Pertanto, la separazione di solito avviene molto rapidamente. Il mezzo utilizzato per la centrifugazione può essere isotonico in tutto il volume a causa dell'inclusione di sali o saccarosio in esso. Non è difficile creare un gradiente delicato, che consente di effettuare una separazione molto efficiente delle frazioni di membrana in base alla loro densità di galleggiamento.
Sorbitolo e mannitolo. Queste sostanze vengono talvolta utilizzate al posto del saccarosio perché, secondo i dati pubblicati, penetrano attraverso alcune membrane biologiche peggio del saccarosio.
Si noti che il glicerolo non viene utilizzato per creare un gradiente di densità perché non può raggiungere valori di densità sufficientemente elevati. I sali di metalli alcalini come CsCl vengono utilizzati solo quando sono richieste soluzioni ad alta densità. Tuttavia, va tenuto presente che alle concentrazioni richieste per creare una densità di equilibrio, questi sali hanno spesso un effetto dannoso sugli organelli di membrana.
Altri metodi vengono utilizzati anche per isolare le membrane dagli omogenati cellulari, sebbene non così frequentemente come la centrifugazione.
1. Distribuzione delle fasi. In questo caso, la separazione delle particelle di membrana avviene in base alle loro proprietà superficiali. A tale scopo si formano due strati immiscibili di soluzioni acquose di vari polimeri idrosolubili. Esempi sono miscele di polietilene glicole destrano e destranficoll. Le particelle di membrana vengono separate in base alla loro affinità per queste fasi. Quest'ultimo può essere selezionato in modo da separare le membrane dalla loro carica superficiale o idrofobicità.
Elettroforesi a flusso libero continuo. In questo caso, la separazione delle particelle avviene in base alla loro carica elettrica. Il farmaco da dividere viene introdotto continuamente in un sottile strato di tampone che scorre lungo una parete verticale. In questo caso, viene applicato un campo elettrico perpendicolare alla direzione del flusso. Pertanto, la separazione elettroforetica delle particelle avviene attraverso il tampone che scorre, che viene raccolto sul fondo della camera sotto forma di frazioni separate.
adsorbimento per affinità. La separazione si basa su un'interazione biospecifica tra i componenti della membrana e la fase solida. Con la scoperta degli anticorpi monoclonali, è stato possibile creare tecniche preparative basate sull'uso di componenti antigenici specifici per l'isolamento della membrana. Gli anticorpi risultanti possono essere attaccati in modo covalente ad un supporto solido e con il loro aiuto effettuare il legame specifico delle rispettive membrane. Molto spesso, questo metodo viene utilizzato per isolare le proteine di membrana. Uno dei problemi che sorgono qui è legato alla selezione delle condizioni di eluizione della membrana che non causerebbero la denaturazione delle proteine.
Un metodo basato sull'uso di microgranuli di gel di silice. Di solito, la quota delle membrane plasmatiche rappresenta non più di 1°7o della massa totale di tutte le membrane delle cellule eucariotiche. Pertanto, l'isolamento di membrane plasmatiche assolutamente pure è associato a grandi difficoltà. Un approccio che è stato sviluppato specificamente per l'isolamento delle membrane plasmatiche si basa sull'uso di microsfere di gel di silice cationizzato. Questi granuli sono fortemente adsorbiti sulla superficie esterna della membrana plasmatica delle cellule intatte e la frazione di membrane plasmatiche associate ai granuli è facilmente separata nel gradiente di densità del saccarosio da altre membrane a causa della maggiore densità dei granuli. Una caratteristica di questo metodo è che nella preparazione risultante, la membrana plasmatica con la sua superficie interna viene trasformata in una soluzione.
4.3 Criteri di purezza per le frazioni di membrana
Forse il criterio più oggettivo per la purezza della frazione di membrana isolata è la presenza in essa di qualche componente unico che è contenuto solo in questa membrana o è predominante in essa. Tipicamente, tali componenti sono enzimi, che in questo caso sono chiamati marcatori. L'elenco degli enzimi marcatori utilizzati per controllare la purezza delle frazioni di membrana è riportato nella tabella 1.2 Quando si determina l'attività di un enzima, si dovrebbe tenere conto del fatto che può essere in forma latente, ad esempio, a causa del fatto che è localizzato sulla superficie interna delle vescicole di membrana secrete. Nella revisione vengono presi in considerazione altri problemi associati alla valutazione della purezza delle membrane isolate. Va notato che i metodi raccomandati nella maggior parte dei casi sono ben sviluppati e standardizzati.
In alcuni casi, i marcatori di membrana più convenienti non sono enzimi, ma recettori specifici per lectine, ormoni, tossine o anticorpi. Se i sistemi in studio sono ben caratterizzati, la purezza della frazione di membrana può essere giudicata dalla sua composizione proteica determinata mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di sodio dodecil solfato. Ad esempio, la membrana esterna dei batteri Gram-negativi ha un insieme caratteristico di polipeptidi che non sono presenti nella membrana citoplasmatica.
Tabella 1.2 Marcatori utilizzati per controllare la purezza delle frazioni di membrana isolate da cellule di mammifero "
Frazione di membrana enzima marcatore Membrane plasmatiche 5"-nucleotidasi Fosfodiesterasi alcalina Na * / K + -ATPasi (basolaterale-
membrana epiteliale cellule) Adenilato ciclasi (basale membrana degli epatociti) Aminopeptidasi (membrana epitelio del bordo del pennello) Mitocondri (interni Citocromo c ossidasi membrana) Succinato-citocromo c-ossido- reduttasi Mitocondri (esterno Monoamino ossidasi membrana) lisosomi Fosfatasi acida 0-galattosendasi perossisomi Catalasi urato ossidasi D-amminoacido ossidasi Membrane degli apparati Galattosiltransferasi golgi endoplasmatico Glucosio-6-fosfatasi reticolo Colina fosfotransferasi NADPH-citocromo c-ossido- reduttasi citosol lattato deidrogenasi Altri criteri che possono essere utilizzati per giudicare la purezza delle membrane includono la loro morfologia, che viene rilevata mediante microscopia elettronica, e le caratteristiche della composizione chimica. Ad esempio, le frazioni che rappresentano la membrana plasmatica, l'apparato di Golgi oi mitocondri possono essere identificate dalla loro morfologia. In alcuni casi, il farmaco è caratterizzato dal contenuto di colesterolo in esso contenuto. Ad esempio, le membrane mitocondriali contengono molto meno colesterolo del Golgi e delle membrane plasmatiche.
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