Вестерн-блоттинг — метод, который заключается в поиске специфических антител против бактерий, вызывающих болезнь Лайма. Что такое тест Вестерн-блот? Как интерпретировать результаты исследования?

Вестерн-блоттинг — это тест, который ищет антитела, которые организм вырабатывает против бактерий, вызывающих болезнь Лайма. На поверхности бактерий существуют антигены, против которых организм имеет специфические антитела в классе IgM и IgG. IgM.

Иммуноглобулины M (IgM) — производятся, когда наш организм впервые встречает данный патоген. Увеличение количества IgM против данного патогена указывает на начало процесса заболевания.

Иммуноглобулины G (IgG) продуцируются организмом после IgM, самый высокий уровень достигается около полугода после заражения, и в отличие от IgM антитела могут сохраняться в крови в течение очень долгого времени, даже нескольких лет.

Тест Вестерн-Блот — показания для проведения

Вестерн-блот используется во втором этапе диагностики боррелиоза — когда тест ELISA (первый тест) дал положительный или сомнительный результат. Однако он не используется, когда тест ELISA дал однозначно отрицательный результат.

Вестерн-блоттинг — в чём заключается тест?

Тест Вестерн-Блот на боррелиоз (болезнь Лайма) точно оценивает антитела к различным фрагментам бактерий. Различные антитела
против отдельных бактериальных фрагментов графически отражены как черные полосы на нитроцеллюлозной бумаге.

1. Для проведения теста необходимы два основных элемента: сыворотка крови пациента и убитые и фрагментированные культивируемые бактерии боррелиоза.

Не делайте этот теста вскоре после укуса клеща. Подождите минимум 4 недели. Стоимость исследования методом Вестерн-Блоттинг в обоих классах антител составляет около 2500-5000 рублей.

2. Под воздействием электрического тока происходит распределение на факторы, в первую очередь бактерий, полученной из культуры клеток, в том числе на бактериальные белки (антигены). Затем эти белки переносят на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрана разрезается на полоски.

3. Полоска с антигенами, в сочетании с сывороткой крови пациента, окрашивается с использованием специальной методики, которая обнаруживает антитела, специфически связанные с антигенами Sprechete Borrelia.

4. В местах, где антитела пациента связаны с белками (антигенами) бактерий боррелиоза, мы замечаем характерные полосы (что указывает на инфекцию бактериями Лайма). Результат теста положительный.

Каждая полоса соответствует бактериальному белку (антиген). Если белки клеток Боррелиоза и антитела не соединяются, полоса не появится. Тогда результат отрицательный.

Тест Вестерн-Блот — когда надо делать?

Ранняя диагностика болезни Лайма проблематична из-за так называемого серологического окна. Это период от начала инфицирования до старта продуцирующего детектируемых антител организмом. В случае болезни Лайма серологическое окно длится в среднем 4 недели.

Выполнение тестов менее чем за 4 недели после укуса клещей создает риск получения ложноотрицательного результата.

Тест Вестерн-Блот — положительный результат

Наличие антител против Боррелий означает, что у вас болезнь Лайма. Однако трудно ответить на вопрос, активна ли инфекция или нет.

IgG-антитела, полученные в результате инфекции, можно обнаружить в крови даже через 10, а иногда через 20 лет после диагноза болезни Лайма.

Также случается, что обнаруженные антитела класса IgM (обычно считающиеся активным маркером инфекции) могут быть постоянными и также не указывают на активную инфекцию.

Тест Вестерн-Блот — отрицательный результат

Тест может дать отрицательный результат в начальный период заболевания, т.е. В первые несколько недель после укуса.

Вестерн-блоттинг может быть выполнен не только при подозрении Лайма, но также при заражении H. pylori (который вызывает язвенную болезнь) или ВИЧ.

Тест Вестерн-блот может дать ложно отрицательный результат и в другой ситуации — когда в старом хроническом боррелиозе производство антител было остановлено или когда антитела были полностью использованы в борьбе с этим заболеванием.

Если подозрение на болезнь Лайма сильное, исследование Вестерн-Блот стоит несколько раз повторять, например, каждые несколько недель, чтобы попасть на такой момент, когда антитела присутствуют в крови.

Наличие антител в активной болезни Лайма варьируется, и у человека с отрицательным результатом есть шанс получить положительный результат при повтороном тесте через несколько недель. Иногда подтверждение диагноза получают только после четвертого или пятого раза.

В этом случае некоторые врачи пытаются получить подтверждение инфекции по-другому: они лечат пациента антибиотиками в течение нескольких недель и через 5-6 недель они направляют его на Вестерн-блоттинг.

Лечение антибиотиками в течение такого времени не может излечить хроническое заболевание, но оно настолько изменяет иммунную систему, что в крови будет достаточно антител, чтобы их можно было обнаружить. Результат Вестерн-блот теста должен интерпретироваться врачом, который специализируется на лечении болезни Лайма

Тест ВБ может проводиться и во время антибактериальной терапии, но с антибиотиками вероятность положительного результата несколько меньше. Самый простой способ диагностировать болезнь с этим тестом — через 6 недель после прекращения терапии антибиотиками.

Важно

Интерпретация исследования — это интерпретация полос. Как правило, следует полагать, что чем больше полос, тем надежнее диагноз. Три полоски это уже действительно большая уверенность, а 5-6 полос — болезнь Лайма с практически 100% вероятностью.

Полосы IgM имеют большее диагностическое значение, поскольку они предполагают активную фазу клещевого боррелиоза, хотя обнаруженные антитела в IgM-классе (полосы IgM) могут быть постоянными и не указывать на активную инфекцию. Оказывается потому, что IgM высок в начале инфекции и, вопреки логике, при хронической болезни Лайма.

Повышенные уровни антител в классе IgG можно рассматривать как остаточную инфекцию, или это означает хроническое активное заболевание.

Даже отрицательный результат теста не означает, что болезнь Лайма отсутствует. Отрицательный результат теста означает только, что в крови нет антител против бактерий боррелиоза — это может иметь место, например, когда бактерии вошли в организм, а производство антител еще не началось (врачи называют этот период серологическим окном).

Из-за множества методов проведения этого исследования трудно сделать универсальные рекомендации относительно интерпретации. Каждая лаборатория использует свои критерии.

Болезнь может быть обнаружена только врачом-специалистом на основании симптомов и результатов лабораторных испытаний. Тест Вестер-Блот нельзя интерпретировать без учёта симптомов.

Содержимое (Table of Contents)

ОФС.1.7.2.0022.15 Определение подлинности и чистоты иммунобиологических лекарственных препаратов методом вестерн-блот

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Вводится впервые

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод вестерн-блот, один из вариантов иммуноблоттинга, который используют для оценки подлинности и чистоты иммунобиологических лекарственных препаратов (ИЛП) на основе высокоочищенных белков, в том числе, полученных по технологии рекомбинантной ДНК.

На первом этапе проводят электрофорез в полиакриламидном геле с натрия додецилсульфатом (так называемый, SDS-PAGE электрофорез) для разделения белков. Затем белки переносят на нитроцеллюлозную мембрану или PVDF-мембрану (мембрана из поливинилденфторида). Детекцию проводят с помощью специфичных к определяемому белку антител, конъюгированных с щелочной фосфатазой или пероксидазой хрена (прямой вариант ИФА), или последовательно с помощью первых антител к определяемому белку, и вторых антител (так называемой, антиглобулиновой сыворотки), специфичных к иммуноглобулину первых антител, конъюгированных с щелочной фосфатазой или пероксидазой хрена (непрямой вариант ИФА).

В данной ОФС изложен метод детекции на основе цветной реакции, как один из наиболее широко применяемых в настоящее время. Для детекции также могут быть использованы хемилюминесцентный метод, в том числе, с усилением хемилюминесценции, и методы радиоактивной или флуоресцентной меток (РИА или РИФ).

Испытание проводят с фармацевтическими субстанциями или с готовой продукцией.

При оценке подлинности, на этапе выполнения электрофореза, помимо испытываемых образцов, должно быть предусмотрено внесение в лунки геля следующих растворов: отрицательный контрольный образец (1-кратный буфер для приготовления образцов), смесь маркеров молекулярных масс (рекомендуется использование предварительно окрашенных маркеров молекулярных масс), стандартный образец испытываемого белка (при его наличии), аттестованный в установленном порядке. При оценке чистоты (примесей) дополнительно должно быть предусмотрено внесение образца с концентрацией белка, соответствующей пределу обнаружения или количественного определения примеси (в зависимости от назначения методики) и установленной на основании результатов валидации методики. При оценке чистоты необходимо сравнение результатов блота с результатами электрофореза в полиакриламидном геле; методика должна выявлять 1 % примеси.

Методика

Для разделения белков по их молекулярным массам предварительно проводят электрофорез в соответствии с методикой, изложенной в и ОФС «Электрофорез в полиакриламидных гелях».

Для проведения переноса белков используют прибор для переноса белков. Все работы проводят в резиновых перчатках. Объем всех используемых растворов должен быть достаточен для полного погружения мембраны, на которую переносят белки.

После проведения электрофореза для подготовки геля к иммуноблотингу, его заливают буферным раствором для переноса белков (если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации), ставят на орбитальный шейкер и выдерживают в течение 10-15 мин. Затем подготавливают лист нитроцеллюлозной или PVDF-мембраны, соответствующий размеру геля. При использовании нитроцеллюлозной мембраны лист выдерживают 5 мин в деионизованной воде, а затем 5 мин в буферном растворе для переноса белков (если нет иных указаний в фармакопейной статье или нормативной документации). При использовании PVDF-мембраны ее необходимо выдержать в растворе метанола или спирта в течение 10-15 мин, а затем произвести аналогичные действия, что и для нитроцеллюлозной мембраны.

Для переноса белков на нитроцеллюлозную или PVDF-мембрану собирают «сэндвич». Для этого специальную губку, входящую в комплект прибора для переноса белков, смачивают в буферном растворе для переноса белков и помещают на специальную пластиковую рамку, на которую затем помещают от одного до трех листов фильтровальной бумаги (например, Whatman 3MM), предварительно обрезанных в соответствии с размером мембраны и смоченных в растворе для переноса белков. Сверху помещают гель, на поверхность которого аккуратно (без пузырьков воздуха) помещают приготовленный лист нитроцеллюлозной или PVDF-мембраны. На мембрану помещают от одного до трех листов фильтровальной бумаги, предварительно смоченных в растворе для переноса белков, и сверху прикрывают второй специальной губкой, смоченной в растворе для переноса белков. Рамку скрепляют зажимами и медленно погружают в прибор для электрофореза, заполненный раствором для переноса белков, лист мембраны должен быть обращен к аноду. Включают прибор. Электрофоретический перенос белков осуществляют при комнатной температуре в течение 25 мин, выставив ограничение по току из расчета A max = 2 мА/см 2 , (например, для геля размером 10×10см 2 A max = 200 мА), если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации.

Допускается использование оборудования для полусухого переноса белков с геля на мембрану в соответствии с инструкцией по его применению.

По окончании переноса «сэндвич» разбирают. Мембрану промывают фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБ).

Оценивают полноту переноса белков визуально по переносу окрашенных маркеров молекулярных масс, все основные белковые полосы которого должны быть выявлены на мембране.

Детекция

Для детекции результатов метода вестерн-блот проводят обработку (гибридизацию) исследуемого препарата антителами. Для этого мембрану с перенесенными на нее белками помещают в контейнер с блокирующим буферным раствором и инкубируют на орбитальном шейкере в течение 30 – 60 мин (если не предусмотрено иное в фармакопейной статье или нормативной документации) для предотвращения неспецифической сорбции антител на мембране.

После этого промывают мембрану в буферном растворе для отмывки трижды по 5 мин, если не указано иное в фармакопейной статье или нормативной документации.

Затем мембрану обрабатывают раствором первых антител к анализируемому белку, приготовленным с использованием буферного раствора для антител (если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации) непосредственно перед использованием в соответствии с инструкцией по применению. Обработку антителами проводят при комнатной температуре в течение 30 – 60 мин (если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации).

Далее трижды по 5 мин проводят отмывку мембраны буферным раствором от несвязавшихся антител на орбитальном шейкере при комнатной температуре, если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации.

После отмывки мембраны, проводят обработку (гибридизацию) раствором вторых антител. В качестве вторых антител используют поликлональные антитела к иммуноглобулинам того вида животного, которое использовалось для получения первых антител. Данные антитела конъюгированы с ферментом (пероксидаза из корней хрена или щелочная фосфатаза). Для выполнения этого этапа повторяют процедуру, описанную выше, заменив раствор первых антител раствором вторых антител. Затем проводят аналогичную первой отмывку мембраны от несвязавшихся вторых антител.

Проявление картины иммуноблота на мембране проводят раствором тетраметилбензидинового субстрата (ТМВ) для антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, или раствором для проявления щелочной фосфатазы – при использовании антител, конъюгированных со щелочной фосфатазой (если нет иных указаний в фармакопейной статье или нормативной документации).

Реакцию останавливают, промывая блот деионизованной водой. С поверхности мембраны удаляют излишек воды фильтровальной бумагой и высушивают на воздухе в темном месте.

Оценка результатов

При оценке подлинности основные окрашенные полосы на проявленной мембране должны соответствовать основным окрашенным полосам на электрофореграмме.

Количество анализируемого вещества и содержание примесей, а также их соотношение оценивают денситометрически.

Критерии пригодности системы

Результаты метода вестер-блот могут учитываться, если:

• маркеры молекулярных масс распределены равномерно по всей длине соответствующей дорожки геля;
• на блоте видны все основные полосы, выявленные при окрашивании геля Кумасси ярко-голубым R-250 или G-250;
• выявляется образец с минимальной концентрацией, установленной в фармакопейной статье или нормативной документации

Критерии приемлемости результатов

• Совпадение блота исследуемого образца с блотом образца сравнения, например, соответствующего стандартного образца на основе очищенного белка (субстанции);
• соответствие молекулярной массы основного выявленного компонента требованиям спецификации;
• соответствие содержания выявляемой примеси в стандартном образце диапазону, установленному в свидетельстве на стандартный образец.

Методику определения подлинности и чистоты методом вестерн – блот следует использовать с подтвержденными валидационными характеристиками в отношении специфичности и предела обнаружения примеси.

Особенности валидация методики

При использовании методики для оценки подлинности необходимо обосновать критерии приемлемости результатов; целесообразно использование стандартного образца на основе очищенного белка, аттестованного в установленном порядке.

При использовании методики для оценки чистоты необходимо обосновывать предел обнаружения примеси. При количественном определении необходимо обосновать предел количественного определения примеси, указать линейный диапазон при определении основного компонента и примесей, прецизионность и правильность методики. Для этого целесообразно использование стандартного образца на основе очищенного белка. При внесении изменений в методику, указанную в фармакопейной статье или нормативной документации, должны быть подтверждены валидационные характеристики ранее утвержденной методики. Валидации подлежат следующие изменения:

• использование различного количества наносимых на гель проб;
• изменение условий переноса белков с геля на мембрану, включая изменение используемого оборудования;
• изменения состава буферных растворов;
• изменение способа детекции исследуемого вещества.

Примечания.

1. Буферный раствор для переноса белков рН 8,3. Если нет иных указаний в фармакопейной статье или нормативной документации, используют один из описанных ниже способов приготовления растворов (см. Вариант 1 и Вариант 2). Раствор для переноса можно использовать 2-3 раза. Раствор хранят в течение 6 мес при температуре от 4 до 8 0 С.

Вариант 1. В градуированный химический стакан вместимостью 3000 мл помещают 7,86 г трис(гидроксиметил)аминометана, 33,75 г глицина, добавляют до 2400,0 мл деионизованной воды и перемешивают на магнитной мешалке до полного растворения. Измеряют рН, который должен быть равен 8,3 – 8,4 (доводить рН раствора кислотой или щелочью не допускается). Добавляют 600,0 мл спирта и перемешивают.

Вариант 2. В градуированный химический стакан вместимостью 1000 мл помещают 5,8 г трис(гидроксиметил)аминометана, 2,9 г глицина, 11,55 мл 10 % раствора натрия додецилсульфата, добавляют 800,0 мл деионизованной воды и перемешивают на магнитной мешалке до полного растворения, измеряют pH (8,3-8,4). Добавляют 200,0 мл 100 % метанола и перемешивают. Если используется PVDF-мембрана, то натрия додецилсульфат из буферного раствора исключают, а количество спирта уменьшают до 100,0 мл, увеличивая тем самым объем добавляемой воды до 900,0 мл.

1. Фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ), рН 7,2 (если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации). В градуированную емкость наливают 4500,0 мл деионизованной воды и последовательно прибавляют: 40,0 г натрия хлорида, 1,0 г калия хлорида 5,75 г натрия фосфорнокислого двузамещенного 2х-водного, 1,0 г калия фосфорнокислого однозамещенного (каждую следующую соль прибавляют после полного растворения предыдущей). Устанавливают рН до 7,2 раствором 70 % ортофосфорной кислоты или раствором 45% натрия гидроксида. Доводят объем до 5000,0 мл деионизованной водой. Раствор фильтруют и хранят в течение 3 мес при температуре 4 — 8 0 С.
2. Буферный раствор для отмывки . В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 5,0 мл 10 % раствора твин-20, доводят объем раствора до метки с помощью ФСБ и перемешивают. Раствор хранят в течение 1 мес при температуре от 4 °С до 8 °С.
3. Блокирующий буферный раствор. К 100,0 мл буферного раствора для отмывки прибавляют 5,0 мг бычьего сывороточного альбумина (или другого белка), если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации, и перемешивают до полного растворения. Раствор готовят перед использованием.
4. Буферный раствор для антител. К 100,0 мл буферного раствора для отмывки прибавляют 2,0 мг бычьего сывороточного альбумина (или других белков), если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации, и перемешивают до полного растворения. Раствор готовят перед использованием.

1. Раствор ТМВ — раствор для проявления пероксидазы хрена. Используют TMB-субстрат, готовый к применению.
2. Раствор для проявления щелочной фосфатазы. Растворяют 1 таблетку субстрата BCIP/NBT в 10,0 мл деионизованной воды. Раствор готовят непосредственно перед использованием.

После того как ДНК, РНК или белки разделены, они должны быть перенесены на твердую подложку для детекции и других операций, которые в геле идут с трудом. Процесс переноса, приводящий к иммобилизации молекул , т.е. закреплению в неподвижном состоянии, называется блоттингом (по англ. – blotting ). В качестве подложки используются нейлоновые или нитроцеллюлозные мембраны.

Блоттинг (от англ. blotting – промокание) – это метод перенесения электрофоретических фрагментов ДНК на специальную пленку (мембрану) из нитроцеллюлозы, связывающую (иммобилизующую) одноцепочечные молекулы ДНК.

Саузерн-блоттинг (по фамилии предложившего его автора) основан на перемещении фрагментов ДНК благодаря капиллярному эффекту. Процесс переноса фрагментов ДНК, находящихся в агарозном геле, на пленку из нитроцеллюлозы с помощью фильтровальной бумаги похож на промокание.

Анализ проводят следующим образом:

– Выделенную, очищенную, денатурированную и разбитую на фрагменты ДНК помещают на лист агарозного геля, где происходит электрофоретическое разделение фрагментов по массе и заряду.

– Лист агарозного геля помещают на фильтровальную бумагу, смоченную концентрированным солевым (буферным) раствором.

– Затем на гель накладывают нитроцеллюлозный фильтр, где происходит иммобилизация (или адсорбция, или фиксация) одноцепочечных фрагментов ДНК.

– Поверх фильтра накладывают стопку листов сухой фильтровальной бумаги, которая обеспечивает медленный ток буферного раствора через гель (т.е. служит своеобразным капиллярным насосом). Солевой раствор, проходя через агарозный гель, увлекает за собой фрагменты ДНК, которые задерживаются нитроцеллюлозой и связываются с ней, а раствор впитывается сухой фильтровальной бумагой.

– Далее ДНК денатурируют щелочью, а фильтр выдерживают в вакууме при температуре 80 0 С, в результате чего одноцепочечные фрагменты ДНК необратимо иммобилизуются (фиксируются) на нитроцеллюлозе. При этом расположение полос иммобилизованной ДНК точно соответствует их расположению в геле.

– ДНК, связанную с фильтром, помещают в раствор с меченым ДНК зондом, в котором и происходит гибридизация. Гибридизироваться (образовывать водородные связи) со специфическим зондом будут только комплементарные ему фрагменты ДНК, которые можно обнаружить в виде светлых полос на рентгеновской пленке, т.е. радиоавтографии нитроцеллюлозного фильтра

Дот-блоттинг . Для приготовления дот-блоттов препарат ДНК или РНК наносят непосредственно на фильтр. Капельки препарата выглядят в виде точек на фильтре, что объясняет название типа блоттинга (англ. dot –точка). 1) Из геномной ДНК, предварительно обработанной ультразвуком, образуются фрагменты длиной 5–10 пар нуклеотидов.

2) Чтобы сделать ДНК- или РНК-пробы доступными зонду, их нужно денатурировать, т.е. перевести в одноцепочечную форму. Это происходит под воздействием температуры 100 °С.

3) Денатурированные нуклеиновые кислоты инкубируют на льду: быстрое понижение температуры предотвращает их ренатурацию, т.е. комплементарное спаривание цепей. Денатурированную ДНК или РНК наносят непосредственно на фильтр, который инкубируют в растворе, содержащем зонд.

4) Чтобы анализируемая нуклеиновая кислота не перешла в раствор, ее необходимо зафиксировать на фильтре (мембране). Для этого используют два типа фильтров: нитроцеллюлозный и нейлоновый.

Для иммобилизации нуклеиновых кислот на нитроцеллюлозном фильтре используют прожаривание при 80 °С в вакууме, а на нейлоновом фильтре – УФ-облучение в течение 3–5 минут.

5) После инкубации препарата нуклеиновых кислот с меченым изотопом зондом проводят радиоавтографию в специальной кассете или идентификацию нерадиоактивными методами.

Дот-блоттинг позволяет ответить только на один вопрос: есть ли в данном образце искомая последовательность нуклеотидов.

Нозерн-блотт анализ применяется:

1) для выделения и анализа РНК (например, для выяснения того, присутствует ли в данном типе клеток мРНК, считанные с данного гена, т.е. экспрессируется ген или нет;

2) для определения количества этой РНК и его изменения в развитии данного типа клеток;

3) для определения размера транскрипта какого-то гена.

В данном случае молекулы РНК, выделенные из клетки, разделяются по размерам с помощью гель-электрофореза, а затем переносятся на фильтр. После гибридизации с меченым одноцепочечным зондом выявляются места гибридизации (гомологии) РНК и зонда.

Если нуклеотидная последовательность искомого гена (или мРНК) не известна, но известен белок, синтез которого он контролирует, то можно выделить небольшое количество чистого белка, определить аминокислотную последовательность некоторой его части (достаточно знание 5–6 аминокислотных остатков). Пользуясь таблицей генетического кода, можно установить все возможные последовательности нуклеотидов в том участке мРНК (или самого гена), который кодирует данную аминокислотную последовательность. В этом случае можно синтезировать зонд для поиска нужных клонов в библиотеке генов.

Вестерн-блоттин г (иммуноэлектроблоттинг, белковый блоттинг) –это метод идентификации уникальных белков. В его основе лежит явление высокоспецифичного взаимодействия антиген–антитело. Таким образом, антигеном (мишенью) является определяемый белок, а зондом – антитело к нему.

Антитела к исследуемому белку получают различными способами. Наиболее простым является введение очищенной пробы белка в кровяное русло лабораторного животного (обычно кролика). В его организме вырабатываются антитела (иммуноглобулины) к данному чужеродному белку. Это первичные антитела, которые и будут взаимодействовать с белком-мишенью.

Однако было бы не рационально вводить метку для идентификации непосредственно в данные антитела. Для определения разных белков потребовалось бы метить разные антитела, что привело бы к их высокой стоимости. Более разумным оказалось использование универсальных антител – конъюгированных антииммуноглобулинов , являющихся, по сути, антителами к антителам, выработанным при использовании идентифицируемого белка как антигена. К примеру, конъюгированные антииммуноглобулины к Ig кролика будут взаимодействовать со всеми иммуноглобулинами, синтезированными у кролика к разным антигенам. Таким образом, именно такие универсальные вторичные антитела несут изотопную или нерадиоактивную метку. Кроме неизотопной метки, которая в ходе ряда реакций приводит к образованию нерастворимого окрашенного соединения (как в случае блоттинга нуклеиновых кислот), очень часто используют хемилюминесцентную метку, обладающую более высокой чувствительностью.

1) Экстракция белков из гомогената

2) Разделение белков по молекулярным массам с помощью SDS-электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ). Метод SDS-электрофореза подразумевает денатурацию нативных белков. Таким образом, молекулы белка, обладающие одинаковой молекулярной массой, пройдут в геле одинаковый путь и выстроятся в виде полосы. Поскольку в смеси присутствуют белковые молекулы разного размера, образуется множество полос. Визуализировать результаты электрофореза можно окрашиванием белка (кумасси бриллиантовый синий, амидо черный, окрашивание серебром). Окрашивание серебром обладает уникальной чувствительностью, что позволяет определить всего 0,1 нг белка в полученной полосе. Это очень важно для контроля количества белка, нанесенного на гель.

3) Перенос белков из геля на мембрану. Это делается потому, что полиакриламид не позволяет диффундировать большим молекулам иммуноглобулинов к белку. А иммобилизованный на мембране белок становится доступным антителам. В отличие от блоттинга нуклеиновых кислот перенос белка на мембрану происходит под воздействием электрических сил, т.е. в электрическом поле.

4) Полученный блот инкубируют с антисывороткой к белку, а затем с антииммуноглобулинами. Результат визуализируют в соответствии с используемым типом метки.

Ограничения:

1) большой размер исследуемых фрагментов, значительно превосходящий длину ДНК-зондов и препятствующий прямому молекулярному анализу;

2) невозможность произвольного выбора концов изучаемых последовательностей, определяющихся наличием соответствующих сайтов рестрикции в исходной молекуле ДНК;

3) необходимость большого количества хорошо очищенной высокомолекулярной геномной ДНК (не менее 10 мкг на одну реакцию, что равноценно 0,5-1 мл крови),

4) для геномной гибридизации - наличие радиоактивных ДНК-зондов с высокой удельной активностью не менее 109 имп./мин*мкг), действующих ограниченный промежуток времени, и специально оборудованного изотопного блока. К тому же длительная экспозиция автографов значительно удлиняет время получения результатов.

5) большая трудоемкость исследований

Вестерн-блот анализ по тестированию количества кальпастатина включал разделение тканевых белков (30 мкг на дорожку) методом электрофореза в 12% ПААГ в присутствии SDS (Laemmli, 1970) с последующим полусухим переносом полипептидов на нитроцеллюлозную мембрану (буфер: 48 мМ Трис-HCl, 39 мМ глицин, 0.0375% SDS, 20% метанол, pH 9.2). После инкубации (2 ч, 20°C) мембраны в буфере TBS (50 мМ Трис-HCl-буфер, 150 мМ NaCl, pH 7.5) проводили блокировку сайтов неспецифического связывания 5% раствором обезжиренного молока в буфере TBST (TBS с добавлением 0.1% Tween 20, pH 7.5) в течение 1 ч. Далее мембрану подвергали последовательному экспонированию с поликлональными антителами к кальпастатину (разведение 1: 2500 в буфере TBST; 1 ч) и с антителами к IgG кролика, конъюгированными с пероксидазой (разведение1: 2000 в буфере TBST; 1 ч); каждый из указанных этапов завершался многократной отмывкой буфером TBST. Мембрану подвергали стандартной обработке системой Immune-Star (Bio-Rad, США).

2.3.6 Другие методы

Концентрацию белка во фракциях определяли методом Брэдфорд (Bradford, 1976) с использованием бычьего сывороточного альбумина (BSA) в качестве стандарта.

Денситометрия полос на зимограммах и рентгеновской пленке проводилась с помощью стандартной программы “Image J”.

Статистическую обработку данных проводили с применением общепринятых методов вариационной статистики с использованием пакетов программ MS Excel и StatGraphics. Достоверность различий оценивали с помощью непараметрического критерия U (критерий Вилкоксона-Манна-Уитни), а также с использованием однофакторного дисперсионного анализа (Коросов, Горбач, 2007).

Глава 3.Результаты исследования и их обсуждение

3.1. Кальпаин/кальпастатиновая система у крыс, подвергнутых индуцированной бета-амилоидом нейродегенерации на фоне эстрогенной терапии

Нейродегенерация индуцировалась у крыс линии Вистар старших возрастных групп – 12 и 24 месяцев. Экспериментальное воздействие заключалось в интрацеребральном введении 42-членного фрагмента амилоидного белка-предшественника – Абета(1-42) (экспериментальная модель болезни Альцгеймера), а также сочетанном интрацеребральном введениие бета-амилоидного пептида и интраназальном введении нейропротектора (эстрадиола). Среди животных были выделены: группа контроля – ложно-оперированные (2 μл физраствора в область правого гиппокампа); первая опытная группа – 2 μл раствора пептида Абета(1-42) (соответствуют 5μг пептида) в область правого гиппокампа; вторая опытная группа – после аналогичной инъекции пептида Абета(1-42) ежедневное интраназальное введение 0,1 мг 17-бета-эстрадиола.

Было обнаружено, что в присутствии амилоидогенного пептида в нервной ткани происходит активация кальпаиновой системы, причем степень активации положительно коррелирует с интенсивностью гибели клеток нервной ткани (плотностью нейронов). Регуляция кальпаинов может осуществляться как на уровне синтеза ферментного белка (или отдельных его форм – продуктов разных генов), так и на посттрансляционном уровне за счет процессов аутолиза, связывания с эндогенным ингибитором кальпастатином или с аллостерическим регулятором – кальцием.

Обнаруженное методом казеиновой зимографии увеличение пула аутолизированных кальпаинов (118 кДа) в группе животных №2 отражает активацию кальпаинов in vivo. Наблюдаемая активация m-кальпаина (120 кДа), по-видимому, как и во многих других ситуациях, сопряжена с избытком кальция в цитоплазме. Еще одним подтверждением этого пути регуляции активности кальпаинов служит стабильный уровень их ингибитора – кальпастатина, обнаруженный в нашем исследовании.

Как оказалось, терапия эстрадиолом обращает эффект гиперактивации кальпаинов, при этом снижается как общая активность кальпаинов в нервной ткани, так и активность индивидуальных фракций. В присутствии эстрадиола меньшая доля предшественника кальпаина подвергается аутолизу, а следовательно, активации. Необходимы дальнейшие исследования механизма регуляции активности кальпаинов у экспериментальных животных, в частности, необходимы эксперименты, направленные на установление источника избыточного кальция и поиск средств, предотвращающих эти патологические токи.

Уровень синтеза протеасом в мозговой ткани невысок в сравнении с другими органами и имеет тенденцию к снижению с возрастом (при сравнении показателей у 18, 24 и 30-месячных животных), о чем судили по количеству альфа-1,2,3,5,6,7 субъединиц протеасом, формирующих альфа-кольца коровой 20S частицы, универсальной для 20S и 26S протеасом.

Было подтверждено изменение уровня экспрессии и активности катепсинов в разных зонах мозга у экспериментальных животных. Интрацеребральное введение бета-амилоидного пептида привело в нашем эксперименте к значительному повышению (p<0,05) экспрессии гена катепсина D в коре (правом полушарии) головного мозга крыс по сравнению с животными контрольной группы. В неокортексе крыс, которые после введения бета-амилоидного пептида получали эстрадиол, относительный уровень экспрессии данного гена не отличался от контрольных значений, то есть восстанавливался до нормального уровня. В области правого гиппокампа введение бета-амилоидного пептида привело к увеличению экспрессии гена катепсина D приблизительно в 7 раз (p<0,001). Последующее введение эстрадиола привело к еще большему возрастанию (в 30 раз) относительной экспрессии указанного гена (p<0,001).

Наши данные продемонстрировали значительное влияние бета-амилоида и эстрадиола на когнитивные функции крыс, оцененные с помощью водного лабиринта Морриса. У заранее обученных самок и самцов крыс после введения бета-амилоидного пептида в гиппокамп значительно (p<0,05) увеличилось время поиска скрытой подводной платформы. Последующее введение эстрадиола сокращало время поиска подводной платформы у животных обоих полов по сравнению с таковыми, получившими только бета-амилоид. При этом у самок время поиска уменьшилось более значимо (p<0,01), чем у самцов (p<0,05).

Результаты конфокальной микроскопии срезов мозга показали, что введение бета-амилоидного пептида привело к значительному увеличению уровня его иммунореактивности в тканях как правого, так и левого (в меньшей степени) полушария головного мозга. Эти результаты, наряду с поведенческими данными, свидетельствуют об эффективности введенного препарата амилоидного пептида и служат доказательством репрезентативности выбранной модели болезни Альцгеймера. Последующее введение эстрадиола привело к снижению количества бета-амилоида в мозге крыс почти до контрольного уровня. Сокращение амилоидных депозитов у крыс, получавших эстрадиол, свидетельствует о запуске в нервной ткани неких адаптационных процессов, направленных на их утилизацию.

Механизм нейропротекторной роли эстрадиола пока полностью не понят, хотя отмечен этот феномен давно. Использование эстрадиола в качестве нейропротектора продиктовано несколькими причинами. Во-первых, нейропротективный эффект эстрадиола довольно хорошо известен и описан в литературе (McEwen et al., 2001; Asimiadou et al., 2005; Lebesgue et al., 2009). Во-вторых, показано, что эстрадиол в полном смысле слова является нейростероидом, так как в мозге имеются все ферменты, необходимые для его синтеза (Stoffel-Wagner, 2001; Reddy, 2010). В-третьих, известно, что нейропротективное действие эстрадиола связано с его антиоксидантным (Behl et al., 1997) и антиапоптотическим (Asimiadou et al., 2005) действием, то есть с эффектами, противоположными эффектам пептида Aбета.

Полученные результаты могут свидетельствовать об адаптивной реакции нервной ткани на введение токсичного пептида. В некоторых публикациях указывается на то, что система лизосомальной аутофагии может принимать участие в деградации бета-амилоидного пептида (Nixon, 2007). Вероятно, эстрадиол стимулирует аутофагию белкового материала; об этом свидетельствуют как данные о содержании пептида Aбета в мозговой ткани, так и оценка активности и уровня экспрессии протеиназ лизосом. Методом флюоресцентной иммуногистохимии было установлено снижение количества бета-пептида у крыс, получавших нейропротективную терапию эстрадиолом.

На основании данных, полученных в эксперименте можно сделать следующие выводы. 1. Уровень экспрессии генов лизосомальных протеиназ CtsD, CtsB, CtsL и альфа-субъединиц протеасом и активность кодируемых ими ферментов в коре головного мозга крыс при старении снижается. Напротив, активность кальпаинов у животных старших возрастных групп повышается. 2. Уровень экспрессии и активности катепсина D, а также интенсивность кальций-зависимого протеолиза значительно возрастают в гиппокампе и коре головного мозга крыс после интрацеребрального введения бета-амилоидного пептида, при этом страдает когнитивная функция животных. 3. Введение эстрадиола на фоне бета-амилоидной интоксикации приводит к уменьшению содержания этого пептида в гиппокампе крыс и улучшению биохимических и поведенческих показателей у экспериментальных животных. 4. Фармакологическая активация лизосомальной функции эстрогенами может способствовать удалению Aбета при болезни Альцгеймера; нормализация кальциевого гомеостаза в этой ситуации предотвращает патологическую активацию кальпаиновой системы, а, вместе с тем, и потерю нейронов по кальпаин-зависимым путям клеточной гибели.

Блоттинг (от англ. "blot " - пятно) - перенос НК, белков и липидов на твердую подложку, например, мембрану и их иммобилизация.

• электрофорез в полиакриламидном геле:
o в денатурирующих условиях с добавлением мочевины - разделение коротких одноцепочечных НК;
o в денатурирующих условиях с добавлением натрия додецилсульфата (электрофорез по Лэммли) - разделение белков по молекулярной массе;
o в нативных условиях - разделение белков по трехмерной структуре;
• изоэлектрофокусирование - для разделения белков по изоэлектрической точке (pI);
• двумерный (2D) электрофорез - для разделения белков в двух направлениях - по изоэлектрической точке и по молекулярной массе;
• электрофорез в агарозном геле - разделение НК:
o по длине линейных фрагментов;
o по "суперспирализации" кольцевых молекул;
• тонкослойная хроматография - разделение липидов из липидных комплексов.

• диффузия молекул - медленный перенос, часто применяется для липидов;
• капиллярный блоттинг - мембрана прижимается к гелю, поверх нее кладется стопка фильтровальной бумаги, буфер для переноса увлажняет гель и поднимается под действием капиллярных сил, смачивая фильтровальную бумагу и перенося макромолекулы из геля на мембрану; капиллярный блоттинг может осуществляться:
o в камерах с увлажнением геля буфером - "полусухим" переносом;
o в камерах с погружением геля в буфер;

• вакуумный блоттинг - аналогичен капиллярному блоттингу, но перенос ускоряется за счет использования вакуума вместо капиллярных сил, создаваемых при смачивании фильтровальной бумаги;
• электроблоттинг - перенос заряженных макромолекул на мембрану происходит под действием электрического тока;
• "пришивание" НК к мембране под действием УФ-облучения или нагрева - для окончательного закрепления на нейлоновых мембранах;
• дот-блоттинг (слот-блоттинг) - нанесение образца производится в виде точки или черточки непосредственно на мембрану без предшествующего разделения молекул в геле или на ТСХ-пластине.

• PVDF-мембраны (поливинилиденфторидные);
• NC-мембраны (нитроцеллюлозные);
• нейлоновые мембраны (применяются для НК).

• окрашивание - связывание красителя (ионов серебра, Кумасси, Понсо, этидия бромистого) непосредственно с детектируемыми макромолекулами;
• иммунохимическое мечение - мечение макромолекул происходит за счет специфически связывающихся с ними меченых антител, детекция осуществляется:
o иммуноокрашиванием - антитела метятся красителями, регистрируется поглощение света определенной длины волны;
o иммуноферментно - антитела метятся ферментом, регистрируется количество окрашенного продукта, наработанного в ходе ферментативной реакции (ИФА);
o хемилюминесцентно - антителя метятся репортерным ферментом, который в присутствии субстрата излучает свечение, регистрируется испускание света
определенной длины волны;
o флуоресцентно - антитела метятся флуоресцентной меткой, которая возбуждается светом определенной длины волны, регистрируется испускание света в
более длинноволновой области;
• радиационное мечение - в макромолекулы вводятся радиационные метки (радиоизотопы), детекция осуществляется с помощью:
o авторадиографии (наложением на мембрану фотопленки);
o радиоимаджинга (количественного определения радиационной эмиссии и построения картины взаимного расположения меток);
• гибридизация - связывание нуклеиновых кислот мечеными олигонуклеотидами с комплементарной структурой, детекция, как правило, осуществляется регистрацией испускания радиационного излучения или флуоресценции метки;
• масс-спектрометрия - используется для прямого структурного анализа липидов.

• Саузерн-блоттинг (блоттинг по Саузерну) - по фамилии Эдвина Саузерна, предложившего метод - определение последовательности ДНК в образце и определение числа копий генов в геномной ДНК. Переносу на мембрану предшествует расщепление образца эндонуклеазами рестрикции на фрагменты и их фракционирование электрофорезом в агарозном геле. Анализ на мембране осуществляется гибридизацией с мечеными олигонуклеотидами известной последовательности;
• нозерн-блоттинг - определение последовательности РНК в образце и изучение генной экспрессии (определение мРНК). Аналогичен блоттингу по Саузерну, но исследуются выделенные из образца молекулы РНК, без расщепления эндонуклеазами. Разделение молекул проводят в агарозном геле с добавлением формальдегида (для денатурации РНК) или в полиакриламидном геле с добавлением мочевины (применяется для анализа микроРНК). Иммобилизация молекул РНК на мембране происходит за счет нагревания под вакуумом или "пришиванием" с помощью УФ-облучения;
• вестерн-блоттинг - белковый иммуноблоттинг - аналитический метод, используемый для определения специфических белков в образце. Переносу на мембрану предшествует разделение белков в полиакриламидном геле. Анализ белков на мембране осуществляется иммунохимически;
• фар-вестерн блоттинг - белковый блоттинг, используется для определения белок-белковых взаимодействий, аналогичен вестерн-блоттингу, но вместо антител используются другие белки, специфически связывающиеся с исследуемым белком;
• соузвестерн-блоттинг - определение белков, связывающихся с ДНК, и сайтов в молекулах ДНК, с которыми связываются белки - аналогичен вестерн-блоттингу, но после денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле белки отмываются от натрия додецилсульфата в присутствии мочевины и за счет диффузии переносятся на нитроцеллюлозную мембрану. В качестве пробы используют меченые фрагменты ДНК разной длины, полученные расщеплением более крупного исследуемого фрагмента геномной ДНК. Связавшиеся молекулы ДНК затем вымываются из каждого комплекса белок-ДНК и анализируются электрофорезом в полиакриламидном геле;
• истерн-блоттинг - определение посттрансляционных модификаций белков (связанных с ними липидов, гликополисахаридов, фосфатных остатков) - аналогичен вестерн-блоттингу, но используются антитела не к белкам, а к липидам, гликополисахаридам и т.д. Также в качестве проб используются помимо антител другие белковые молекулы связывающиеся с исследуемыми (например, лектин);
• фар-истерн-блоттинг - анализ липидов, разделенных высокоэффективной тонкослойной хроматографией. Перенос на мембрану, как правило, осуществляется за счет диффузии. Регистрация производится прямым масс-спектрометрическим структурным анализом.