përmbajtja

- Hyrje
- Zgjidhjet
- Liza e mostrës
- Përgatitja e mostrës
- Kryerja e elektroforezës
- Transferimi i proteinave nga PAGE në membranë
- Lyerje me membranë

Hyrje

Western blotting është një metodë analitike e përdorur për të identifikuar proteinat specifike në një kampion të ndarë me elektroforezë me xhel poliarilamid. Më pas, proteinat nga xheli transferohen në një membranë nitrocelulozë ose PVDF, më pas proteinat me interes zbulohen duke përdorur antitrupa specifikë për një proteinë të veçantë dhe zhvillohen duke përdorur antitrupa dytësorë.

Zgjidhjet

Buferi i lizës
Bufer NP-40
150 mM NaCl
1,0% NP-40 (Tergitol® tip NP-40)
50 mM Tris-HCl, pH 8.0
Frenuesit e proteazës

Shembull buffer (x5)
10% SDS
5% 2-merkaptoetanol
50% glicerinë
0.01% bromfenol blu
0,4 M Imidazol

Kontrolloni pH dhe rregullojeni në pH 6.8

Tampon ndarës (bufer xheli ndarës më i ulët)
400 mM Tris-HCl
0.1% SDS
0.01% TEMED
0.1% persulfat natriumi



Tampon transferimi (gjysmë i thatë)
16 mM Tris-HCl
200 mM Glicinë
0.1% SDS
20% metanol

Kontrolloni pH dhe rregullojeni në pH 8.3

Bufer për bllokim
150 mM NaCl
10 mM Na 2 HPO 4
3-5% qumësht pluhur i skremuar



Bufer larës (PBST)
150 mM NaCl
10 mM Na 2 HPO 4
0.2% Tween-20

Kontrolloni pH dhe rregullojeni në pH 7.5

Liza e mostrës

Përgatitja e lizatit nga kultura qelizore

1. Vendoseni enën që përmban qelizat në akull dhe shpëlajini qelizat me PBS të ftohur.

2. Hiqeni plotësisht tretësirën PBS, më pas shtoni tampon të ftohtë të lizës (1 ml për 10 7 qeliza/150 cm 2; 0,5 ml për 5x10 6 qeliza/75 cm 2).

3. Ndani qelizat nga plastika, më pas transferojeni me kujdes suspensionin e qelizave në një tub centrifuge të ftohtë.

4. Inkuboni tubin me suspension me përzierje të vazhdueshme për 30 minuta në +4℃.

5. Centrifugoni pezullimin në +4℃. Shpejtësia standarde e rekomanduar është 12,000 rpm për 20 minuta, por këto parametra duhet të përcaktohen për eksperimentin specifik dhe llojin e qelizës.

6. Mblidhni supernatantin që rezulton

Përgatitja e lizatit të indeve

1. Ndani një pjesë të indit që ekzaminohet duke përdorur instrumente të pastra.

2. Vendoseni indin në një tub centrifuge. Shtoni tampon të ftohtë të lizës (0,3 ml/5 mg ind) në tub. Grini mostrën duke përdorur një homogjenizues. Shpëlajini tehet e homogjenizuesit me 0,2 ml tampon lize të ftohur. Shtoni larjen në mostër. Shmangni hollimin e tepërt të kampionit. Përqendrimi minimal i ngarkesës është 0.1 mg/ml. Gama optimale - 1-5 mg/ml

3. Inkuboni tubin me suspension me përzierje të vazhdueshme për 2 orë në +4℃

4. Centrifugoni pezullimin në 12000 rpm për 20 minuta në +4℃

5. Mblidhni supernatantin që rezulton

Përgatitja e mostrës

1. Përcaktoni përqendrimin e proteinave në lizat që rezultojnë.

2. Përcaktoni sasinë e proteinës së nevojshme për ngarkim dhe shtoni 5X tampon mostër në kampion në vëllim 4 herë më pak.

Ne rekomandojmë përdorimin e mostrave të rindërtuara dhe të denatyruara

3. Për të rivendosur dhe denatyruar mostrën, ajo duhet të zihet në tampon kampion në +100℃ për 5 minuta.

Kryerja e elektroforezës

Vendosni sasi të barabarta mostrash dhe shënues të peshës molekulare në puse të një xhel poliakrilamid. Ngarkesa e lizatit duhet të jetë 20-30 μg proteina totale, ngarkesa e proteinës së pastër duhet të jetë 10-100 ng.
Kryeni elektroforezën e proteinave në xhel poliakrilamid

Për transferim mund të përdoret membrana nitrocelulozë ose PVDF. Aktivizoni membranën PVDF duke e zhytur fillimisht në metanol për 1 minutë. Përpara transferimit, lajeni atë në tampon transferimi. Ne rekomandojmë përdorimin e një metode gjysmë të thatë për të transferuar proteinat në membranë. Shtrirja e transferimit të proteinave në membranë mund të kontrollohet duke përdorur ngjyrën Ponceau S përpara se të bllokohet membrana.

Përgatitni membranën e transferimit sipas ilustrimit

1. Shpëlajeni membranën me tretësirë ​​PBS.

2. Për të bllokuar vendet jo specifike lidhëse, inkuboni membranën në tretësirën tampon bllokues gjatë natës në +4℃ ose për 40 minuta në +37℃ me përzierje të vazhdueshme.

3. Për të larë membranën, inkubohet 3 herë në tretësirë ​​PBST për 5 minuta në +37 ℃ dhe me përzierje të vazhdueshme.

4. Inkuboni me antitrupa ndaj proteinës së provës në tretësirën PBS për 40 minuta në +37℃ dhe me përzierje të vazhdueshme.

5. Për të larë membranën, inkuboni atë 3 herë në tretësirë ​​PBST për 5 minuta në +37 ℃ dhe me përzierje të vazhdueshme.

6. Inkuboni membranën me antitrupa dytësorë kundër specieve (imunokonjugate) në tretësirë ​​PBS për 40 minuta në +37 ℃ dhe me përzierje të vazhdueshme.

7. Shpëlajeni membranën 5 herë në tretësirë ​​PBST për 5 minuta në +37 ℃ dhe me përzierje të vazhdueshme.

8. Për të zbuluar antitrupat e lidhur të konjuguar me peroksidazën e rrikës, ne rekomandojmë përdorimin e një solucioni substrati DAB.

Blotting(nga anglishtja" njollë" - spot) - transferimi i NC-ve, proteinave dhe lipideve në një mbështetje të fortë, për shembull, një membranë dhe imobilizimi i tyre.

• elektroforezë në xhel poliakrilamid:
o në kushte denatyrimi me shtimin e uresë - ndarja e NA-ve të shkurtra me një zinxhir;
o në kushte denatyrimi me shtimin e dodecilsulfatit të natriumit (elektroforeza Laemmli) - ndarja e proteinave sipas peshës molekulare;
o në kushte amtare - ndarja e proteinave sipas strukturës së tyre tredimensionale;
• fokusimi izoelektrik - për ndarjen e proteinave sipas pikës izoelektrike (pI);
• elektroforezë dydimensionale (2D) - për ndarjen e proteinave në dy drejtime - nga pika izoelektrike dhe nga pesha molekulare;
• Elektroforeza e xhelit të agarozës - Ndarja NC:
o përgjatë gjatësisë së fragmenteve lineare;
o nga “supermbështjellja” e molekulave unazore;
• kromatografia me shtresë të hollë - ndarja e lipideve nga komplekset lipidike.

• difuzioni i molekulave - transport i ngadaltë, i përdorur shpesh për lipide;
• blotting kapilar - membrana shtypet kundër xhelit, mbi të vendoset një pirg letre filtri, buferi i transferimit lag xhelin dhe ngrihet nën veprimin e forcave kapilare, duke lagur letrën filtri dhe duke transferuar makromolekulat nga xheli në cipë; blotimi kapilar mund të kryhet:
o në dhomat me xhel të lagur me një tampon - transferim "gjysmë i thatë";
o në dhomat me zhytje me xhel në tampon;

• blotting me vakum - i ngjashëm me blotting kapilar, por transferimi përshpejtohet duke përdorur një vakum në vend të forcave kapilare të krijuara nga lagja e letrës filtruese;
• elektroblotting - transferimi i makromolekulave të ngarkuara në membranë ndodh nën ndikimin e një rryme elektrike;
• "qepja" e NC në membranë nën ndikimin e rrezatimit UV ose ngrohjes - për fiksim përfundimtar në membranat najloni;
• blotting me pika (slot blotting) - kampioni aplikohet në formën e një pike ose vize direkt në membranë pa ndarje paraprake të molekulave në një xhel ose në një pllakë TLC.

• Membrana PVDF (fluorid poliviniliden);
• membranat NC (nitroceluloza);
• membranat najloni (përdoren për NDT).

• ngjyrosje - lidhja e një ngjyre (jonet e argjendit, Coomassie, Ponceau, bromidi etidium) drejtpërdrejt me makromolekulat e zbuluara;
• Etiketimi imunokimik - etiketimi i makromolekulave ndodh për shkak të antitrupave të etiketuar që lidhen posaçërisht me to, zbulimi kryhet:
o imuno-ngjyrosja - antitrupat etiketohen me ngjyra, regjistrohet thithja e dritës me një gjatësi vale të caktuar;
o analiza e imunitetit enzimë - antitrupat etiketohen me një enzimë, regjistrohet sasia e produktit me ngjyrë të prodhuar gjatë reaksionit enzimatik (ELISA);
o kimilumineshent - antitrupat janë etiketuar me një enzimë raportuese, e cila lëshon një shkëlqim në prani të një substrati dhe emetimi i dritës regjistrohet
një gjatësi vale të caktuar;
o fluoreshente - antitrupat janë etiketuar me një etiketë fluoreshente, e cila ngacmohet nga drita e një gjatësi vale të caktuar, emetimi i dritës regjistrohet në
rajon me gjatësi vale më të gjatë;
• etiketimi i rrezatimit - etiketat e rrezatimit (radioizotopet) futen në makromolekulat, zbulimi kryhet duke përdorur:
o autoradiografi (duke aplikuar film fotografik në membranë);
o Imazhe me radio (përcaktimi sasior i emetimit të rrezatimit dhe ndërtimi i një fotografie të pozicionit relativ të shenjave);
• hibridizimi - lidhja e acideve nukleike me oligonukleotide të etiketuara me një strukturë plotësuese, si rregull, kryhet duke regjistruar emetimin e rrezatimit ose fluoreshencën e etiketës;
• spektrometria e masës - përdoret për analiza të drejtpërdrejta strukturore të lipideve.

• Njoftim jugor(Southern blotting) - emëruar pas Edwin Southern, i cili propozoi metodën - përcaktimi i sekuencës së ADN-së në një mostër dhe përcaktimi i numrit të kopjeve të gjenit në ADN gjenomike. Transferimi në membranë paraprihet nga tretja e kampionit me anë të kufizimit të endonukleazave në fragmente dhe fraksionimi i tyre me elektroforezë në një xhel agaroze. Analiza e membranës kryhet me hibridizimin me oligonukleotide të etiketuara me sekuencë të njohur;
• Njohuri verior- përcaktimi i sekuencës së ARN-së në kampion dhe studimi i shprehjes së gjeneve (përcaktimi i mARN). Ngjashëm me Southern blotting, por molekulat e ARN-së të izoluara nga kampioni ekzaminohen, pa tretje endonukleaze. Ndarja e molekulave kryhet në një xhel agarozë me shtimin e formaldehidit (për denatyrimin e ARN) ose në një xhel poliakrilamid me shtimin e uresë (përdoret për analizën e mikroRNA). Imobilizimi i molekulave të ARN-së në membranë ndodh për shkak të ngrohjes nën vakum ose "lidhjes së kryqëzuar" duke përdorur rrezatimin UV;
• Western blotting- Imunobllotimi i proteinave është një metodë analitike që përdoret për të identifikuar proteinat specifike në një kampion. Transferimi në membranë paraprihet nga ndarja e proteinave në një xhel poliakrilamid. Analiza e proteinave në membranë kryhet në mënyrë imunokimike;
• far Western blotting- proteina blotting, që përdoret për të përcaktuar ndërveprimet protein-proteinë, e ngjashme me Western blotting-in, por në vend të antitrupave përdoren proteina të tjera që lidhen në mënyrë specifike me proteinën në studim;
• Njoftim jugor- përcaktimi i proteinave që lidhen me ADN-në dhe vendeve në molekulat e ADN-së me të cilat lidhen proteinat - e ngjashme me Western blotting, por pas denatyrimit të elektroforezës në një xhel poliakrilamid, proteinat lahen nga sulfati dodecil natriumi në prani të uresë dhe transferohen në membrana nitroceluloze me difuzion. Si mostër, përdoren fragmente të etiketuara të ADN-së me gjatësi të ndryshme, të marra duke ndarë një fragment më të madh të ADN-së gjenomike në studim. Molekulat e lidhura të ADN-së më pas lahen nga çdo kompleks protein-ADN dhe analizohen me elektroforezë me xhel poliakrilamid;
• blotting Lindore- përcaktimi i modifikimeve post-përkthimore të proteinave (lipide të lidhura, glikopolisakaridet, mbetjet e fosfatit) - të ngjashme me Western blotting, por antitrupat përdoren jo ndaj proteinave, por ndaj lipideve, glikopolisaharideve, etj. Përveç antitrupave, molekula të tjera proteinike që lidhen me subjektet e testimit (për shembull, lektina) përdoren gjithashtu si mostra;
• blotting larg-lindore- analiza e lipideve të ndara me kromatografi me shtresë të hollë me performancë të lartë. Transferimi në membranë zakonisht realizohet me difuzion. Regjistrimi kryhet me analizë strukturore të drejtpërdrejtë spektrometrike të masës.

Western blot(ndonjëherë quhet proteina imunoblot dëgjo)) është një metodë analitike e përdorur gjerësisht e përdorur në biologjinë molekulare, imunogjenetikë dhe disiplina të tjera të biologjisë molekulare për të përcaktuar proteinat specifike në një mostër homogjenimi ose ekstraktimi të indeve.

Shkurtimisht, kampioni i nënshtrohet denatyrimit të proteinave dhe më pas elektroforezës me xhel. Një antitrup sintetik ose me prejardhje nga kafshët (i njohur si antitrup primar) që krijohet njeh dhe lidhet me një proteinë specifike të synuar. Membrana e elektroforezës lahet në një tretësirë ​​që përmban antitrupin primar përpara se të lahet antitrupi i tepërt. Shtohet një antitrup dytësor që njeh dhe lidhet me antitrupin primar. Antitrupi sekondar u vizualizua duke përdorur metoda të ndryshme, të tilla si ngjyrosja, imunofluoreshenca dhe radioaktiviteti, i cili lejon zbulimin indirekt të një proteine ​​specifike të synuar.

Metoda të tjera të lidhura përfshijnë analizën e pikave, analizën sasiore të pikave, imunohistokiminë dhe imunocitokiminë, ku antitrupat përdoren për të zbuluar proteinat në inde dhe qelizat e etiketimit imunitar, dhe analizën imunosorbente të lidhur me enzimën (ELISA).

Emri western blotështë një lojë në "Southern blot" të titulluar me të njëjtin emër, një teknikë e zbulimit të ADN-së e zhvilluar më parë nga Edwin Southern. Për më tepër, zbulimi i ARN-së quhet blot verior dhe u zhvillua nga James Alwine, David Kemp dhe George Stark në Stanford. Termi "Western blot" iu dha teknikës nga W. Neil Burnett, megjithëse vetë metoda e kishte origjinën në laboratorin e Harry Towbin.

Aplikacionet

Western blot përdoret gjerësisht në biokimi për përcaktimin cilësor të proteinave të vetme dhe modifikimeve të proteinave (për shembull, modifikimi pas përkthimit). Përdoret si një metodë e përgjithshme për të përcaktuar praninë e një proteine ​​të vetme specifike në një përzierje komplekse proteinash. Një vlerësim gjysmë sasior i një proteine ​​mund të merret nga madhësia dhe intensiteti i ngjyrës së brezit të proteinave në membranën e blotit. Për më tepër, përdorimi i hollimeve serike të proteinave të pastruara me përqendrime të njohura mund të përdoret për të lejuar një vlerësim më të saktë të përqendrimit të proteinave. Western blot përdoret zakonisht për të kontrolluar prodhimin e proteinave pas klonimit. Përdoret gjithashtu në diagnostikimin mjekësor, siç është testi HIV ose BSE-TEST.

Një test konfirmues për HIV përdor një blot Western për të zbuluar antitrupat anti-HIV në mostrën e serumit të një personi. Proteinat nga qelizat e njohura të infektuara me HIV ndahen dhe aplikohen në membranë siç përshkruhet më sipër. Serumi i testimit aplikohet më pas në hapin primar të inkubacionit të antitrupave; Antitrupi i lirë shpërlahet dhe shtohet një antitrup dytësor anti-njerëzor i shoqëruar me sinjalin e enzimës. Shiritat me ngjyra tregojnë më pas proteinat ndaj të cilave serumi i pacientit përmban antitrupa.

Western blots përdoren gjithashtu si një test përfundimtar për sëmundjen Creutzfeldt-Jakob, një lloj sëmundjeje prion që lidhet me konsumimin e viçit të kontaminuar nga të mëdhenjtë. bagëti me encefalopati spongiforme të gjedhit (BSE, zakonisht i referuar si "sëmundja e lopës së çmendur").

Një aplikim tjetër është në diagnostikimin e tularemisë. Një vlerësim i aftësisë së Western blot për të zbuluar antitrupat kundër F. tularensis tregoi se ndjeshmëria e tij ishte pothuajse 100% dhe specifika e tij ishte 99.6%.

zbulimi kolorimetrik

Metoda e zbulimit kolorimetrik varet nga inkubimi i Western blot me një substrat që ndërvepron me një enzimë raportuese (si p.sh. peroksidaza) që lidhet me një antitrup dytësor. Kjo e shndërron ngjyrën e tretshme në një formë të patretshme të një ngjyre të ndryshme, e cila precipiton pranë enzimës dhe kështu ngjyros membranën. Zhvillimi i njollës më pas ndalet duke shpëlarë ngjyrën e tretshme. Nivelet e proteinave u vlerësuan duke përdorur densitometrinë (si pikë intensive) ose spektrofotometri.

Zbulimi kimilumineshent

Metodat e zbulimit kimilumineshent varen nga inkubimi i Western blot me një substrat, i cili do të ndriçojë kur ekspozohet ndaj një antitrupi dytësor raportues. Drita më pas zbulohet nga kamerat CCD, të cilat kapin imazhin dixhital në një blot Western ose film fotografik. Përdorimi i filmit për zbulimin e blotit Western po zhduket gradualisht për shkak të mungesës së linearitetit të imazhit (jo kuantifikimi i saktë). Imazhi analizohet duke përdorur densitometrinë, e cila vlerëson sasinë relative të ngjyrosjes së proteinave dhe përcakton rezultatet në terma të densitetit optik. Në vijim software lejon analiza të mëtejshme të të dhënave si analiza e peshës molekulare nëse përdoren standardet e duhura.

Analiza Western blot për të testuar sasinë e kalpastatinës përfshin ndarjen e proteinave të indeve (30 μg për korsi) me elektroforezë në 12% PAGE në prani të SDS (Laemmli, 1970) e ndjekur nga transferimi gjysmë i thatë i polipeptideve në një membranë nitroceluloze. tampon: 48 mM Tris-HCl, 39 mM glicinë, 0.0375% SDS, 20% metanol, pH 9.2). Pas inkubimit (2 orë, 20°C) të membranës në tampon TBS (bufer 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,5), vendet lidhëse jo specifike u bllokuan me një zgjidhje 5% të qumështit të skremuar në tampon TBST (TBS me shtimin e 0.1% Tween 20, pH 7.5) për 1 orë Më pas, membrana u ekspozua në mënyrë sekuenciale ndaj antitrupave poliklonalë ndaj kalpastatinës (hollimi 1: 2500 në tampon TBST; 1 orë) dhe me antitrupa ndaj IgG të lepurit (konjuguar me peroksidazë). hollimi 1: 2000 në tampon TBST 1 orë); Secili prej këtyre hapave u përfundua duke larë të përsëritur me tampon TBST. Membrana iu nënshtrua trajtimit standard me sistemin Immune-Star (Bio-Rad, SHBA).

2.3.6 Metoda të tjera

Përqendrimi i proteinave fraksionet u përcaktuan me metodën Bradford (Bradford, 1976) duke përdorur albuminën e serumit të gjedhit (BSA) si standard.

Densitometria vija në zimogramë dhe film me rreze X u kryen duke përdorur programin standard "Image J".

Përpunimi statistikor i të dhënave u kryen duke përdorur metoda të pranuara përgjithësisht të statistikave të variacionit duke përdorur paketat softuerike MS Excel dhe StatGraphics. Rëndësia e diferencave u vlerësua duke përdorur testin joparametrik U (testi Wilcoxon-Mann-Whitney), si dhe duke përdorur analizën e variancës në një drejtim (Korosov, Gorbach, 2007).

Kapitulli 3. Rezultatet e kërkimit dhe diskutimi

3.1. Sistemi i kalpainës/kalpastatinës në minjtë e nënshtruar neurodegjenerimit të shkaktuar nga beta-amiloide gjatë terapisë me estrogjen

Neurodegjenerimi u shkaktua në minjtë më të vjetër Wistar grupmoshat– 12 dhe 24 muaj. Efekti eksperimental konsistonte në administrimin intracerebral të një fragmenti 42-anëtarësh të proteinës pararendëse amiloide - Abeta(1-42) (një model eksperimental i sëmundjes së Alzheimerit), si dhe administrimi i kombinuar intracerebral i peptidit beta-amiloide dhe administrimi intranazal i një neuroprotektor (estradiol). Midis kafshëve u identifikuan: grupi i kontrollit - i operuar me shami (2 μl tretësirë ​​të kripur në zonën e hipokampusit të djathtë); grupi i parë eksperimental - 2 μl zgjidhje peptide Abeta (1-42) (që korrespondon me 5 μg peptid) në zonën e hipokampusit të djathtë; grupi i dytë eksperimental - pas një injeksioni të ngjashëm të peptidit Abeta(1-42), administrimi ditor intranazal i 0.1 mg 17-beta-estradiol.

U zbulua se në prani të peptidit amiloidogjen në ind nervor aktivizohet sistemi i kalpainës dhe shkalla e aktivizimit lidhet pozitivisht me intensitetin e vdekjes së qelizave të indit nervor (densiteti i neuroneve). Rregullimi i kalpainës mund të kryhet si në nivelin e sintezës së proteinës enzimë (ose formave të saj individuale - produkte të gjeneve të ndryshme), dhe në nivelin pas përkthimit për shkak të proceseve të autolizës, lidhjes me frenuesin endogjen kalpastatin ose tek rregullatori alosterik - kalciumi.

Rritja e grupit të kalpainave të autolizuara (118 kDa) e zbuluar nga zymografia e kazeinës në grupin e kafshëve nr. 2 pasqyron aktivizimin e kalpainave in vivo. Aktivizimi i vëzhguar i m-kalpainës (120 kDa), me sa duket, si në shumë situata të tjera, shoqërohet me kalcium të tepërt në citoplazmë. Një tjetër konfirmim i kësaj rruge të rregullimit të aktivitetit të kalpainës është niveli i qëndrueshëm i frenuesit të tyre, kalpastatinës, i zbuluar në studimin tonë.

Siç doli, terapia me estradiol anulon efektin e hiperaktivizimit të kalpainës, me uljen e aktivitetit të përgjithshëm të kalpainës në indin nervor dhe aktivitetit të fraksioneve individuale. Në prani të estradiolit, një pjesë më e vogël e prekursorit të kalpainës i nënshtrohet autolizës dhe, rrjedhimisht, aktivizimit. Nevojiten studime të mëtejshme të mekanizmit të rregullimit të aktivitetit të kalpainës në kafshët eksperimentale, në veçanti, nevojiten eksperimente që synojnë përcaktimin e burimit të kalciumit të tepërt dhe gjetjen e mjeteve për të parandaluar këto rryma patologjike.

Niveli i sintezës së proteazomës në indet e trurit është i ulët në krahasim me organet e tjera dhe tenton të ulet me moshën (kur krahasohen treguesit në kafshët 18, 24 dhe 30 muajsh), siç gjykohet nga sasia e alfa-1,2,3 ,5,6 ,7 nënnjësi proteazome që formojnë unaza alfa të grimcave bërthamore 20S, universale për proteazomet 20S dhe 26S.

Ndryshimet në nivelin e shprehjes dhe aktivitetit të katepsinave në zona të ndryshme të trurit te kafshët eksperimentale u konfirmuan. Në eksperimentin tonë, administrimi intracerebral i peptidit beta-amiloide çoi në një rritje të konsiderueshme (p<0,05) экспрессии гена катепсина D в коре (правом полушарии) головного мозга крыс по сравнению с животными контрольной группы. В неокортексе крыс, которые после введения бета-амилоидного пептида получали эстрадиол, относительный уровень экспрессии данного гена не отличался от контрольных значений, то есть восстанавливался до нормального уровня. В области правого гиппокампа введение бета-амилоидного пептида привело к увеличению экспрессии гена катепсина D приблизительно в 7 раз (p<0,001). Последующее введение эстрадиола привело к еще большему возрастанию (в 30 раз) относительной экспрессии указанного гена (p<0,001).

Të dhënat tona treguan efekte të rëndësishme të beta-amiloidit dhe estradiolit në performancën njohëse te minjtë e vlerësuar duke përdorur labirintin e ujit Morris. Në minjtë femra dhe meshkuj të trajnuar më parë, pas injektimit të peptidit beta-amiloide në hipokampus, pati një (p<0,05) увеличилось время поиска скрытой подводной платформы. Последующее введение эстрадиола сокращало время поиска подводной платформы у животных обоих полов по сравнению с таковыми, получившими только бета-амилоид. При этом у самок время поиска уменьшилось более значимо (p<0,01), чем у самцов (p<0,05).

Rezultatet e mikroskopisë konfokale të seksioneve të trurit treguan se administrimi i peptidit beta-amiloide çoi në një rritje të konsiderueshme të nivelit të imunoreaktivitetit të tij në indet e hemisferës së djathtë dhe të majtë (në një masë më të vogël) të trurit. Këto rezultate, së bashku me të dhënat e sjelljes, demonstrojnë efektivitetin e ilaçit peptid amiloide të administruar dhe ofrojnë dëshmi për përfaqësimin e modelit të zgjedhur të sëmundjes Alzheimer. Administrimi i mëvonshëm i estradiolit reduktoi sasinë e beta-amiloidit në trurin e minjve në nivele pothuajse të kontrollit. Reduktimi i depozitave të amiloidit në minjtë e trajtuar me estradiol tregon fillimin e disa proceseve adaptive në indin nervor që synojnë përdorimin e tyre.

Mekanizmi i rolit neuroprotektiv të estradiolit ende nuk është kuptuar plotësisht, megjithëse ky fenomen është vërejtur për një kohë të gjatë. Përdorimi i estradiolit si një neuroprotektor diktohet nga disa arsye. Së pari, efekti neuroprotektiv i estradiolit është mjaft i njohur dhe i përshkruar në literaturë (McEwen et al., 2001; Asimiadou et al., 2005; Lebesgue et al., 2009). Së dyti, është treguar se estradioli është një neurosteroid në kuptimin e plotë të fjalës, pasi truri përmban të gjitha enzimat e nevojshme për sintezën e tij (Stoffel-Wagner, 2001; Reddy, 2010). Së treti, dihet se efekti neuroprotektiv i estradiolit shoqërohet me efektet e tij antioksiduese (Behl et al., 1997) dhe antiapoptotike (Asimiadou et al., 2005), pra me efekte të kundërta me ato të peptidit Abeta.

Rezultatet e marra mund të tregojnë një përgjigje adaptive të indit nervor ndaj futjes së një peptidi toksik. Disa publikime tregojnë se sistemi i autofagjisë lizozomale mund të përfshihet në degradimin e peptidit beta-amiloide (Nixon, 2007). Ka të ngjarë që estradioli të stimulojë autofagjinë e materialit proteinik; Kjo dëshmohet si nga të dhënat për përmbajtjen e peptidit Abeta në indet e trurit ashtu edhe nga vlerësimi i aktivitetit dhe nivelit të shprehjes së proteinazave lizozomale. Imunohistokimia fluoreshente zbuloi një ulje të sasisë së peptidit beta në minjtë që merrnin terapi neuroprotektive me estradiol.

Bazuar në të dhënat e marra në eksperiment, mund të nxirren përfundimet e mëposhtme. 1. Niveli i shprehjes së gjeneve të proteinazave lizozomale CtsD, CtsB, CtsL dhe nënnjësive alfa të proteazomave dhe aktiviteti i enzimave që ato kodojnë në korteksin cerebral të minjve zvogëlohet me plakjen. Përkundrazi, aktiviteti i kalpainave në kafshët e grupmoshave më të mëdha rritet. 2. Niveli i shprehjes dhe aktivitetit të katepsinës D, si dhe intensiteti i proteolizës së varur nga kalciumi, rritet ndjeshëm në hipokampus dhe korteksin cerebral të minjve pas administrimit intracerebral të peptidit beta-amiloide, dhe funksioni njohës i kafshëve vuan. . 3. Administrimi i estradiolit në sfondin e intoksikimit me beta-amiloide çon në një ulje të përmbajtjes së këtij peptidi në hipokampusin e minjve dhe një përmirësim të treguesve biokimikë dhe të sjelljes në kafshët eksperimentale. 4. Aktivizimi farmakologjik i funksionit lizozomal nga estrogjenet mund të nxisë heqjen e Abeta në sëmundjen e Alzheimerit; normalizimi i homeostazës së kalciumit në këtë situatë parandalon aktivizimin patologjik të sistemit kalpain dhe, në të njëjtën kohë, humbjen e neuroneve përgjatë rrugëve të vdekjes së qelizave të varura nga kalpaina.

Tabela e Përmbajtjes

GPM.1.7.2.0022.15 Përcaktimi i autenticitetit dhe pastërtisë së produkteve medicinale imunobiologjike duke përdorur metodën Western blot

ARTIKU I PËRGJITHSHËM FARMAKOPE

Prezantohet për herë të parë

Kjo monografi e përgjithshme farmakopeale zbatohet për metodën Western blot, një nga variantet e imunoblotting-it, e cila përdoret për të vlerësuar origjinalitetin dhe pastërtinë e produkteve medicinale imunobiologjike (IMPs) të bazuara në proteina shumë të pastruara, përfshirë ato të marra duke përdorur teknologjinë e ADN-së rekombinante.

Në fazën e parë, elektroforeza kryhet në xhel poliakrilamid me dodecil sulfat natriumi (e ashtuquajtura elektroforezë SDS-PAGE) për të ndarë proteinat. Proteinat më pas transferohen në një membranë nitroceluloze ose membranë PVDF. Zbulimi kryhet duke përdorur antitrupa specifikë për proteinën që zbulohet, të konjuguar me fosfatazë alkaline ose peroksidazë rrikë (versioni i drejtpërdrejtë i ELISA), ose duke përdorur në mënyrë sekuenciale antitrupat e parë ndaj proteinës që zbulohet dhe antitrupat e dytë (të ashtuquajturat serum antiglobulin). ), antitrupat e parë specifikë për imunoglobulinën, të konjuguar me fosfatazën alkaline ose peroksidazën e rrikës (versioni indirekt i ELISA).

Ky OFS përshkruan një metodë zbulimi të bazuar në një reaksion ngjyre, si një nga më të përdorurat aktualisht. Për zbulimin, mund të përdoren gjithashtu metoda kemilumineshente, duke përfshirë kimilumineshencën e zgjeruar dhe metodat e etiketimeve radioaktive ose fluoreshente (RIA ose RIF).

Testi kryhet me substanca farmaceutike ose produkte të gatshme.

Gjatë vlerësimit të autenticitetit, në fazën e elektroforezës, përveç mostrave të provës, duhet të shtohen zgjidhjet e mëposhtme në pusetat e xhelit: një kampion kontrolli negativ (buferi i përgatitjes së mostrës 1-fish), një përzierje e shënuesve të peshës molekulare (përdorimi i Rekomandohen shënues të peshës molekulare të ngjyrosur paraprakisht), një mostër standarde e proteinës që testohet (nëse disponohet), e çertifikuar në mënyrën e përcaktuar. Kur vlerësohet pastërtia (papastërtitë), duhet të sigurohet shtesë për shtimin e një kampioni me një përqendrim të proteinës që korrespondon me kufirin e zbulimit ose sasisë së papastërtive (në varësi të qëllimit të metodës) dhe të vendosur në bazë të rezultateve të metodës. vërtetimi. Kur vlerësohet pastërtia, është e nevojshme të krahasohen rezultatet e blotit me rezultatet e elektroforezës së xhelit të poliakrilamidit; teknika duhet të zbulojë 1% papastërti.

Metodologjia

Për të ndarë proteinat sipas peshës së tyre molekulare, elektroforeza kryhet fillimisht në përputhje me procedurën e përshkruar në Monografinë e Farmakopesë së Përgjithshme "Elektroforeza në xhel poliakrilamide".

Për të kryer transferimin e proteinave, përdoret një pajisje për transferimin e proteinave. E gjithë puna kryhet duke përdorur doreza gome. Vëllimi i të gjitha solucioneve të përdorura duhet të jetë i mjaftueshëm për të zhytur plotësisht membranën në të cilën transferohen proteinat.

Pas elektroforezës për përgatitjen e xhelit për imunoblotting, ai mbushet me një tretësirë ​​tampon për transferimin e proteinave (përveç rasteve kur tregohet ndryshe në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator), vendoset në një shaker orbital dhe mbahet për 10-15 minuta. Më pas përgatitet një fletë nitroceluloze ose membranë PVDF që korrespondon me madhësinë e xhelit. Kur përdoret një membranë nitroceluloze, fleta mbahet për 5 minuta në ujë të deionizuar, dhe më pas 5 minuta në një tretësirë ​​tampon për transferimin e proteinave (përveç rasteve kur tregohet ndryshe në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator). Kur përdorni një membranë PVDF, ajo duhet të mbahet në një tretësirë ​​metanoli ose alkooli për 10-15 minuta dhe më pas duhet të kryhen të njëjtat hapa si për një membranë nitroceluloze.

Për të transferuar proteinat në një membranë nitrocelulozë ose PVDF, mblidhet një "sanduiç". Për ta bërë këtë, një sfungjer i veçantë i përfshirë me pajisjen e transferimit të proteinave laget me tretësirë ​​tampon transferimi të proteinave dhe vendoset në një kornizë të veçantë plastike, mbi të cilën një deri në tre fletë letre filtri (për shembull, Whatman 3MM), të prera paraprakisht për t'u përshtatur. madhësia e membranës dhe proteinat e njomura në tretësirën e transferimit. Sipër vendoset një xhel, në sipërfaqen e të cilit vendoset me kujdes një fletë e përgatitur me membranë nitroceluloze ose PVDF (pa flluska ajri). Nga një deri në tre fletë letre filtri, të lagur paraprakisht në një tretësirë ​​të transferimit të proteinave, vendosen në membranë dhe mbulohen nga sipër me një sfungjer të dytë special të njomur në një zgjidhje transferuese proteinash. Korniza është e fiksuar me kapëse dhe e zhytur ngadalë në një pajisje elektroforeze të mbushur me një zgjidhje të transferimit të proteinave, fleta e membranës duhet të jetë përballë anodës. Ndizni pajisjen. Transferimi elektroforetik i proteinave kryhet në temperaturën e dhomës për 25 minuta, duke vendosur kufirin aktual në shpejtësinë A max = 2 mA/cm 2 (për shembull, për një xhel me përmasa 10 × 10 cm 2 A max = 200 mA), përveç nëse tregohet ndryshe në artikullin ose dokumentacionin rregullator të farmakopesë.

Lejohet përdorimi i pajisjeve për transferimin gjysmë të thatë të proteinave nga xheli në membranë në përputhje me udhëzimet për përdorimin e tij.

Pas përfundimit të transferimit, "sanduiçi" çmontohet. Membrana lahet me solucion fiziologjik të puferuar me fosfat (PBS).

Plotësia e transferimit të proteinave vlerësohet vizualisht nga transferimi i shënuesve me ngjyrë të peshës molekulare, të gjitha brezat kryesore të proteinave të të cilave duhet të zbulohen në membranë.

Zbulimi

Për të zbuluar rezultatet e metodës Western blot, ilaçi testues trajtohet (hibridizohet) me antitrupa. Për ta bërë këtë, membrana me proteinat e transferuara në të vendoset në një enë me një zgjidhje tampon bllokues dhe inkubohet në një shaker orbital për 30-60 minuta (përveç rasteve kur parashikohet ndryshe në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator) për të parandaluar thithjen jospecifike të antitrupa në membranë.

Pas kësaj, lani membranën në një tretësirë ​​tampon larës tre herë për 5 minuta, përveç nëse specifikohet ndryshe në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator.

Pastaj membrana trajtohet me një tretësirë ​​të antitrupave të parë ndaj proteinës që analizohet, e përgatitur duke përdorur një tretësirë ​​tampon për antitrupa (përveç rasteve kur tregohet ndryshe në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator) menjëherë përpara përdorimit në përputhje me udhëzimet për përdorim. Trajtimi me antitrupa kryhet në temperaturën e dhomës për 30-60 minuta (përveç nëse tregohet ndryshe në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator).

Më pas, membrana lahet tre herë për 5 minuta secila me një zgjidhje tampon për të hequr antitrupat e palidhur në një shaker orbital në temperaturën e dhomës, përveç nëse tregohet ndryshe në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator.

Pas larjes së membranës, trajtimi (hibridizimi) kryhet me një zgjidhje të antitrupave të dytë. Antitrupat poliklonalë ndaj imunoglobulinave të specieve shtazore që janë përdorur për të marrë antitrupat e parë përdoren si antitrupa të dytë. Këto antitrupa janë të konjuguar me një enzimë (peroksidazë rrikë ose fosfatazë alkaline). Për të kryer këtë hap, përsëritni procedurën e përshkruar më sipër, duke zëvendësuar tretësirën e parë të antitrupave me një tretësirë ​​të dytë të antitrupave. Pastaj membrana lahet për të hequr antitrupat e dytë të palidhur, të ngjashëm me të parën.

Zhvillimi i modelit imunoblot në membranë kryhet me një zgjidhje të substratit tetrametilbenzidine (TMB) për antitrupat e konjuguar me peroksidazën e rrikës, ose një zgjidhje për zhvillimin e fosfatazës alkaline - kur përdorni antitrupa të konjuguar me fosfatazën alkaline (përveç nëse tregohet ndryshe në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator).

Reagimi ndërpritet duke e larë blotin me ujë të dejonizuar. Uji i tepërt hiqet nga sipërfaqja e membranës me letër filtri dhe thahet në ajër në një vend të errët.

Vlerësimi i rezultateve

Gjatë vlerësimit të autenticitetit, brezat me ngjyra kryesore në membranën e zhvilluar duhet të korrespondojnë me brezat me ngjyra kryesore në elektroferogram.

Sasia e analitit dhe përmbajtja e papastërtive, si dhe raporti i tyre, vlerësohen në mënyrë densitometrike.

Kriteret e përshtatshmërisë së sistemit

Rezultatet e metodës Western blot mund të merren parasysh nëse:

• Shënuesit e peshës molekulare shpërndahen në mënyrë të barabartë përgjatë gjithë gjatësisë së gjurmës përkatëse të xhelit;
• njolla tregon të gjitha shiritat kryesore të identifikuara kur xheli lyhet me Coomassie blu të ndezur R-250 ose G-250;
• identifikohet një mostër me përqendrimin minimal të përcaktuar në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator

Kriteret e pranimit të rezultateve

• Përputhja e njollës së mostrës së provës me blotin e kampionit të referencës, për shembull, kampionit standard përkatës të bazuar në proteinën (substancën) e pastruar;
• pajtueshmëria e peshës molekulare të komponentit kryesor të identifikuar me kërkesat e specifikimeve;
• përputhshmëria e përmbajtjes së papastërtisë së zbuluar në kampionin standard me diapazonin e vendosur në certifikatën për kampionin standard.

Metoda Western blot për përcaktimin e identitetit dhe pastërtisë duhet të përdoret me karakteristika të vërtetuara të vërtetimit për specifikën dhe kufirin e zbulimit të papastërtisë.

Karakteristikat e vërtetimit të metodës

Kur përdoret një metodologji për vlerësimin e autenticitetit, është e nevojshme të arsyetohen kriteret për pranueshmërinë e rezultateve; Këshillohet përdorimi i një kampioni standard të bazuar në proteina të pastruar, të çertifikuar në mënyrën e përcaktuar.

Kur përdorni një metodë për të vlerësuar pastërtinë, është e nevojshme të justifikoni kufirin e zbulimit të papastërtisë. Kur bëni një përcaktim sasior, është e nevojshme të justifikoni kufirin e përcaktimit sasior të papastërtisë, të tregoni diapazonin linear kur përcaktoni përbërësin kryesor dhe papastërtitë, saktësinë dhe korrektësinë e metodës. Për këtë qëllim, këshillohet përdorimi i një kampioni standard të bazuar në proteina të pastruar. Kur bëhen ndryshime në metodën e specifikuar në monografinë farmakopeale ose në dokumentacionin rregullator, duhet të konfirmohen karakteristikat e vërtetimit të metodës së miratuar më parë. Ndryshimet e mëposhtme i nënshtrohen vërtetimit:

• përdorimi i numrave të ndryshëm të mostrave të aplikuara në xhel;
• ndryshimi i kushteve për transferimin e proteinave nga xheli në membranë, duke përfshirë ndryshimin e pajisjeve të përdorura;
• ndryshimet në përbërjen e tretësirave tampon;
• ndryshimi i metodës së zbulimit të substancës testuese.

Shënime

1. Tretësirë ​​buferike për transferimin e proteinave pH 8.3. Nëse nuk ka udhëzime të tjera në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator, përdorni një nga metodat për përgatitjen e solucioneve të përshkruara më poshtë (shih Opsionin 1 dhe Opsionin 2). Zgjidhja e transferimit mund të përdoret 2-3 herë. Tretësira ruhet për 6 muaj në një temperaturë prej 4 deri në 8 0 C.

Opsioni 1. 7,86 g tris(hidroksimetil)aminometan, 33,75 g glicinë vendosen në një gotë të shkallëzuar me kapacitet 3000 ml, shtohen deri në 2400,0 ml ujë të deionizuar dhe trazohen në një përzierës magnetik deri në tretje të plotë. Matet pH, i cili duhet të jetë i barabartë me 8,3 - 8,4 (nuk lejohet rregullimi i pH-së së tretësirës me acid ose alkali). Shtoni 600.0 ml alkool dhe përzieni.

Opsioni 2. 5,8 g tris(hidroksimetil)aminometan, 2,9 g glicinë, 11,55 ml solucion dodecil sulfat natriumi 10% vendosen në një gotë të shkallëzuar me kapacitet 1000 ml, shtohen 800,0 ml ujë të dejonizuar dhe trazohen në një trazues magnetik. shpërbërja e plotë, matet pH (8,3-8,4). Shtoni 200.0 ml metanol 100% dhe përzieni. Nëse përdoret një membranë PVDF, atëherë dodecil sulfati i natriumit përjashtohet nga tretësira tampon dhe sasia e alkoolit zvogëlohet në 100.0 ml, duke rritur kështu vëllimin e ujit të shtuar në 900.0 ml.

1. I kripur i puferuar me fosfat (PBS), pH 7.2(nëse nuk tregohet ndryshe në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator). 4500,0 ml ujë të dejonizuar hidhet në një enë të graduar dhe shtohet radhazi: 40,0 g klorur natriumi, 1,0 g klorur kaliumi, 5,75 g fosfat natriumi i zëvendësuar 2-ujor, 1,0 g kripë kaliumi i shtuar është foshub. shpërbërja e plotë e të mëparshmes). Vendosni pH në 7.2 me një tretësirë ​​prej 70% acid fosforik ose një tretësirë ​​prej 45% hidroksid natriumi. Rregulloni volumin në 5000.0 ml me ujë të dejonizuar. Tretësira filtrohet dhe ruhet për 3 muaj në temperaturën 4 - 8 0 C.
2. Zgjidhje tampon për larje. Shtoni 5,0 ml të një solucioni 10% Tween-20 në një balonë vëllimore 1000 ml, rregulloni volumin e tretësirës në shenjë duke përdorur PBS dhe përzieni. Tretësira ruhet për 1 muaj në një temperaturë prej 4 °C deri në 8 °C.
3. Zgjidhje tampon bllokues. Në 100,0 ml tretësirë ​​tampon për larje, shtoni 5,0 mg albuminë të serumit të gjedhit (ose proteina tjetër), përveç nëse tregohet ndryshe në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator, dhe përzieni derisa të treten plotësisht. Tretësira përgatitet para përdorimit.
4. Zgjidhje tampon antitrupash. Në 100,0 ml tretësirë ​​tampon për larje, shtoni 2,0 mg albuminë të serumit të gjedhit (ose proteina të tjera), përveç nëse tregohet ndryshe në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator, dhe përzieni derisa të treten plotësisht. Tretësira përgatitet para përdorimit.

1. Zgjidhja TMB— zgjidhje për zhvillimin e peroksidazës së rrikës. Përdorni substratin TMB, gati për përdorim.
2. Zgjidhje për zhvillimin e fosfatazës alkaline. Shkrihet 1 tabletë e substratit BCIP/NBT në 10,0 ml ujë të dejonizuar. Zgjidhja përgatitet menjëherë para përdorimit.