Conţinut

- Introducere
- Soluții
- Liza probei
- Pregătirea probei
- Efectuarea electroforezei
- Transfer de proteine ​​de la PAGE la membrană
- Pictura pe membrană

Introducere

Western blot este o metodă analitică utilizată pentru a identifica proteine ​​specifice într-o probă separată prin electroforeză pe gel de poliarilamidă. Apoi, proteinele din gel sunt transferate pe o membrană de nitroceluloză sau PVDF, apoi proteinele de interes sunt detectate folosind anticorpi specifici unei anumite proteine ​​și dezvoltate folosind anticorpi secundari.

Soluții

Tampon de liză
Tampon NP-40
150 mM NaCI
1,0% NP-40 (Tergitol® tip NP-40)
50 mM Tris-HCI, pH 8,0
Inhibitori de protează

Buffer de probă (x5)
10% SDS
5% 2-mercaptoetanol
50% glicerină
0,01% albastru de bromofenol
0,4 M imidazol

Verificați pH-ul și ajustați la pH 6,8

Tampon de separare (tampon de gel de separare inferior)
400 mM Tris-HCI
0,1% SDS
0,01% TEMED
0,1% persulfat de sodiu



Tampon de transfer (semisescat)
16 mM Tris-HCI
Glicină 200 mM
0,1% SDS
20% metanol

Verificați pH-ul și ajustați la pH 8,3

Buffer pentru blocare
150 mM NaCI
10 mM Na2HP04
3-5% lapte praf degresat



Tampon de spălare (PBST)
150 mM NaCI
10 mM Na2HP04
0,2% Tween-20

Verificați pH-ul și ajustați la pH 7,5

Liza probei

Prepararea lizatului din cultura celulară

1. Așezați recipientul care conține celulele pe gheață și clătiți celulele cu PBS răcit.

2. Îndepărtați complet soluția de PBS, apoi adăugați tampon de liză răcit (1 ml la 10 7 celule/150 cm2; 0,5 ml per 5x106 celule/75 cm2).

3. Separați celulele de plastic, apoi transferați cu atenție suspensia de celule într-un tub de centrifugă răcit.

4. Incubați tubul cu suspensia cu agitare constantă timp de 30 de minute la +4℃.

5. Centrifugați suspensia la +4℃. Viteza standard recomandată este de 12.000 rpm timp de 20 de minute, dar acești parametri trebuie să fie determinați pentru experimentul specific și tipul de celulă.

6. Se colectează supernatantul rezultat

Prepararea lizatului de țesut

1. Separați o porțiune din țesutul examinat folosind instrumente curate.

2. Puneți țesutul într-un tub de centrifugă. Se adaugă tampon de liză răcit (0,3 ml/5 mg țesut) în tub. Se macină proba folosind un omogenizator. Clătiți lamele omogenizatorului cu 0,2 ml tampon de liză răcit. Adăugați spălarea la probă. Evitați diluarea excesivă a probei. Concentrația minimă de încărcare este de 0,1 mg/ml. Interval optim - 1-5 mg/ml

3. Se incubează tubul cu suspensia cu agitare constantă timp de 2 ore la +4℃

4. Se centrifugă suspensia la 12000 rpm timp de 20 min la +4℃

5. Se colectează supernatantul rezultat

Pregătirea probei

1. Determinați concentrația de proteine ​​din lizatele rezultate.

2. Determinați cantitatea de proteină necesară pentru încărcare și adăugați tampon de probă de 5X la probă într-un volum de 4 ori mai mic.

Vă recomandăm să folosiți probe reconstituite și denaturate

3. Pentru a restabili și a denatura proba, aceasta trebuie fiartă în tampon de probă la +100℃ timp de 5 minute.

Efectuarea electroforezei

Puneți cantități egale de probe și marker de greutate moleculară în godeurile unui gel de poliacrilamidă. Sarcina de lizat ar trebui să fie de 20-30 μg de proteină totală, încărcătura de proteine ​​​​pure ar trebui să fie de 10-100 ng.
Efectuați electroforeza proteinelor în gel de poliacrilamidă

Pentru transfer poate fi utilizată nitroceluloză sau membrană PVDF. Activați membrana PVDF prin înmuierea mai întâi în metanol timp de 1 minut. Înainte de transfer, spălați-l în tampon de transfer. Vă recomandăm să folosiți o metodă semi-uscată pentru a transfera proteinele pe membrană. Gradul de transfer al proteinei către membrană poate fi verificat folosind colorant Ponceau S înainte de a bloca membrana.

Pregătiți membrana de transfer conform ilustrației

1. Clătiți membrana cu soluție de PBS.

2. Pentru a bloca locurile de legare nespecifice, incubați membrana în soluție tampon de blocare peste noapte la +4℃ sau timp de 40 de minute la +37℃ cu agitare constantă.

3. Pentru a spăla membrana, incubați-o de 3 ori în soluție PBST timp de 5 minute la +37 ℃ și amestecând constant.

4. Se incubează cu anticorpi la proteina de testat în soluție de PBS timp de 40 de minute la +37 ℃ și se agită constant.

5. Pentru a spăla membrana, incubați-o de 3 ori în soluție PBST timp de 5 minute la +37℃ și amestecând constant

6. Incubați membrana cu anticorpi anti-specie secundari (imunoconjugate) în soluție de PBS timp de 40 de minute la +37 ℃ și agitare constantă.

7. Clătiți membrana de 5 ori în soluție PBST timp de 5 minute la +37 ℃ și amestecând constant.

8. Pentru a detecta anticorpii legați conjugați cu peroxidază de hrean, vă recomandăm să utilizați o soluție de substrat DAB.

Ştergerea(din engleza " pata" - spot) - transfer de NC, proteine ​​și lipide pe un suport solid, de exemplu, o membrană și imobilizarea acestora.

• electroforeza in gel de poliacrilamida:
o în condiții de denaturare cu adaos de uree - separarea NA-urilor scurte cu un singur lanț;
o în condiţii de denaturare cu adaos de dodecil sulfat de sodiu (electroforeza Laemmli) - separarea proteinelor după greutatea moleculară;
o în condiţii native - separarea proteinelor în funcţie de structura lor tridimensională;
• focalizare izoelectrică - pentru separarea proteinelor prin punct izoelectric (pI);
• electroforeza bidimensionala (2D) - pentru separarea proteinelor in doua directii - prin punct izoelectric si prin greutate moleculara;
• Electroforeză pe gel de agaroză - separare NC:
o pe lungimea fragmentelor liniare;
o prin „superbobinarea” moleculelor inelului;
• cromatografia în strat subțire - separarea lipidelor de complexele lipidice.

• difuzia moleculelor - transport lent, adesea folosit pentru lipide;
• blotting capilar - membrana este presată pe gel, deasupra ei se pune un teanc de hârtie de filtru, tamponul de transfer umezește gelul și se ridică sub acțiunea forțelor capilare, umezind hârtia de filtru și transferând macromoleculele din gel în membrană; blotting capilar poate fi efectuat:
o în camere cu gelul umezit cu un tampon - transfer „semisec”;
o în camere cu imersie de gel în tampon;

• vacuum blotting - similar cu capilar blotting, dar transferul este accelerat prin folosirea unui vid în locul forțelor capilare create prin umezirea hârtiei de filtru;
• electroblotting - transferul macromoleculelor încărcate pe membrană are loc sub influența unui curent electric;
• „coaserea” NC pe membrană sub influența iradierii UV sau a încălzirii - pentru fixarea finală pe membranele de nailon;
• dot blotting (slot blotting) - proba se aplică sub formă de punct sau liniuță direct pe membrană fără separarea prealabilă a moleculelor într-un gel sau pe o placă TLC.

• Membrane PVDF (fluorura de poliviniliden);
• membrane NC (nitroceluloză);
• membrane de nailon (utilizate pentru NDT).

• colorare - legarea unui colorant (ioni de argint, Coomassie, Ponceau, bromură de etidio) direct la macromoleculele detectate;
• marcarea imunochimică - marcarea macromoleculelor are loc din cauza anticorpilor marcați care se leagă în mod specific la acestea;
o imunocolorare - anticorpii sunt marcați cu coloranți, se înregistrează absorbția luminii de o anumită lungime de undă;
o imunotest enzimatic - anticorpii sunt marcați cu o enzimă, se înregistrează cantitatea de produs colorat produsă în timpul reacției enzimatice (ELISA);
o chemiluminiscent - anticorpii sunt marcați cu o enzimă reporter, care emite o strălucire în prezența unui substrat, iar emisia de lumină este înregistrată
o anumită lungime de undă;
o fluorescent - anticorpii sunt marcați cu o etichetă fluorescentă, care este excitată de lumina de o anumită lungime de undă, emisia de lumină este înregistrată în
regiune cu lungime de undă mai mare;
• marcarea radiațiilor - etichetele de radiații (radioizotopi) sunt introduse în macromolecule, detectarea se realizează folosind:
o autoradiografie (prin aplicarea de peliculă fotografică pe membrană);
o imagistica radio (determinarea cantitativă a emisiei de radiații și construirea unei imagini a poziției relative a marcajelor);
• hibridizare - legarea acizilor nucleici cu oligonucleotide marcate cu o structură complementară, de regulă, se realizează prin înregistrarea emisiei de radiație sau fluorescență a etichetei;
• spectrometrie de masă – utilizată pentru analiza structurală directă a lipidelor.

• Southern blot(Southern blotting) - numit după Edwin Southern, care a propus metoda - determinarea secvenței ADN dintr-o probă și determinarea numărului de copii ale genelor din ADN-ul genomic. Transferul pe membrană este precedat de digestia probei prin endonucleaze de restricție în fragmente și fracționarea lor prin electroforeză într-un gel de agaroză. Analiza membranei este efectuată prin hibridizare cu oligonucleotide marcate de secvenţă cunoscută;
• Northern blot- determinarea secvenței ARN din probă și studiul expresiei genelor (determinarea ARNm). Similar cu Southern blot, dar moleculele de ARN izolate din probă sunt examinate, fără digestie cu endonuclează. Separarea moleculelor se realizează într-un gel de agaroză cu adaos de formaldehidă (pentru denaturarea ARN) sau într-un gel de poliacrilamidă cu adaos de uree (utilizat pentru analiza microARN). Imobilizarea moleculelor de ARN pe membrană are loc datorită încălzirii sub vid sau „reticulare” folosind iradierea UV;
• Western blot- Imunoblotarea proteinelor este o metodă analitică utilizată pentru a identifica anumite proteine ​​dintr-o probă. Transferul pe membrană este precedat de separarea proteinelor într-un gel de poliacrilamidă. Analiza proteinelor de pe membrană se realizează imunochimic;
• far western blot- protein blotting, folosit pentru determinarea interacțiunilor proteină-proteină, asemănător Western blotting, dar în locul anticorpilor se folosesc alte proteine ​​care se leagă specific de proteina studiată;
• Southern blot- determinarea proteinelor care se leagă de ADN și a situsurilor din moleculele de ADN de care se leagă proteinele - similar cu Western blotting, dar după electroforeza de denaturare într-un gel de poliacrilamidă, proteinele sunt spălate din dodecil sulfat de sodiu în prezența ureei și sunt transferate într-un membrana de nitroceluloza prin difuzie. Ca probă se folosesc fragmente de ADN marcate de lungimi diferite, obținute prin divizarea unui fragment mai mare de ADN genomic aflat în studiu. Moleculele de ADN legate sunt apoi spălate din fiecare complex proteină-ADN și analizate prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă;
• Eastern blot- determinarea modificărilor post-translaționale ale proteinelor (lipide asociate, glicopolizaharide, reziduuri de fosfat) - asemănător Western blotting, dar anticorpii sunt folosiți nu la proteine, ci la lipide, glicopolizaharide etc. În plus față de anticorpi, alte molecule de proteine ​​care se leagă de subiecții de testat (de exemplu, lectina) sunt, de asemenea, folosite ca probe;
• blotting din Extremul Orient- analiza lipidelor separate prin cromatografie în strat subțire de înaltă performanță. Transferul pe membrană se realizează de obicei prin difuzie. Înregistrarea se realizează prin analiză structurală directă spectrometrică de masă.

Western blot(uneori numit proteina imunoblot asculta)) este o metodă analitică utilizată pe scară largă în biologia moleculară, imunogenetică și alte discipline de biologie moleculară pentru a determina proteine ​​specifice într-o probă de omogenat de țesut sau de extras.

Pe scurt, proba este supusă denaturarii proteinelor și apoi electroforezei pe gel. Un anticorp sintetic sau de origine animală (cunoscut ca anticorp primar) care este creat recunoaște și se leagă de o proteină țintă specifică. Membrana de electroforeză este spălată într-o soluție care conține anticorpul primar înainte ca excesul de anticorp să fie spălat. Se adaugă un anticorp secundar care recunoaște și se leagă de anticorpul primar. Anticorpul secundar a fost vizualizat folosind diverse metode, cum ar fi colorarea, imunofluorescența și radioactivitatea, care permite detectarea indirectă a unei proteine ​​țintă specifice.

Alte metode înrudite includ analiza dot blot, analiza cantitativă dot blot, imunohistochimia și imunocitochimia, în care anticorpii sunt utilizați pentru a detecta proteinele în țesuturi și celulele marcate imun și testul imunosorbent legat de enzime (ELISA).

Nume western blot este o piesă cu titlul eponim Southern blot, o tehnică de detectare a ADN-ului dezvoltată anterior de Edwin Southern. În plus, detectarea ARN se numește Northern blot și a fost dezvoltată de James Alwine, David Kemp și George Stark la Stanford. Termenul de „Western blot” a fost dat tehnicii de W. Neil Burnett, deși metoda în sine își are originea în laboratorul lui Harry Towbin.

Aplicații

Western blot este utilizat pe scară largă în biochimie pentru determinarea calitativă a proteinelor individuale și a modificărilor proteinelor (de exemplu, modificarea post-translațională). Este utilizat ca metodă generală pentru a determina prezența unei singure proteine ​​specifice într-un amestec complex de proteine. O estimare semicantitativă a unei proteine ​​poate fi obținută din mărimea și intensitatea culorii benzii proteice de pe membrana blot. În plus, utilizarea de diluții în serie de proteine ​​purificate de concentrații cunoscute poate fi utilizată pentru a permite o estimare mai precisă a concentrației de proteine. Western blot este folosit în mod obișnuit pentru a verifica producția de proteine ​​după clonare. Este, de asemenea, utilizat în diagnosticul medical, cum ar fi testul HIV sau BSE-TEST.

Un test de confirmare pentru HIV utilizează un Western blot pentru a detecta anticorpii anti-HIV în proba de ser a unei persoane. Proteinele din celulele infectate cu HIV cunoscute sunt separate și aplicate pe membrană așa cum este descris mai sus. Serul de testare este apoi aplicat la etapa de incubare a anticorpului primar; anticorpul liber este spălat și se adaugă un anticorp secundar anti-uman cuplat la semnalul enzimatic. Benzile colorate arată apoi proteinele pentru care serul pacientului conține anticorpi.

Western blot sunt, de asemenea, folosite ca un test definitiv pentru boala Creutzfeldt-Jakob, un tip de boală prionică asociată cu consumul de carne de vită contaminată de la mare. bovine cu encefalopatie spongiformă bovină (ESB, denumită în mod obișnuit „boala vacii nebune”).

O altă aplicație este în diagnosticul tularemiei. O evaluare a capacității Western blot de a detecta anticorpi împotriva F. tularensis a arătat că sensibilitatea sa a fost de aproape 100% și specificitatea sa de 99,6%.

detecție colorimetrică

Metoda de detectare colorimetrică depinde de incubarea Western blot cu un substrat care interacționează cu o enzimă reporter (cum ar fi peroxidaza) care este legată de un anticorp secundar. Aceasta transformă colorantul solubil într-o formă insolubilă de altă culoare, care precipită lângă enzimă și astfel colorează membrana. Dezvoltarea petei este apoi oprită prin levigarea colorantului solubil. Nivelurile de proteine ​​au fost evaluate folosind densitometrie (ca punct intens) sau spectrofotometrie.

Detectare chemiluminiscentă

Metodele de detectare chemiluminiscente depind de incubarea Western blot cu un substrat, care va luminesce atunci când este expus la un anticorp secundar reporter. Lumina este apoi detectată de camerele CCD, care captează imaginea digitală pe un Western blot sau film fotografic. Folosirea filmului pentru detectarea Western blot dispare treptat din cauza lipsei de liniaritate a imaginii (cuantificare neexactă). Imaginea este analizată folosind densitometrie, care evaluează cantitatea relativă de colorare a proteinei și cuantifică rezultatele în termeni de densitate optică. Urmând software permite analize suplimentare de date, cum ar fi analiza greutății moleculare, dacă sunt utilizate standarde adecvate.

Analiza Western blot pentru a testa cantitatea de calpastatină a implicat separarea proteinelor tisulare (30 μg pe bandă) prin electroforeză în 12% PAGE în prezența SDS (Laemmli, 1970) urmată de transferul semi-uscat al polipeptidelor pe o membrană de nitroceluloză ( tampon: 48 mM Tris-HCI, 39 mM glicină, 0,0375% SDS, 20% metanol, pH 9,2). După incubarea (2 ore, 20°C) a membranei în tampon TBS (tampon Tris-HCl 50 mM, NaCI 150 mM, pH 7,5), locurile de legare nespecifice au fost blocate cu o soluție 5% de lapte degresat în tampon TBST (TBS). cu adăugarea de 0,1% Tween 20, pH 7,5) timp de 1 oră. Apoi, membrana a fost expusă secvenţial la anticorpi policlonali la calpastatină (diluţie 1: 2500 în tampon TBST; 1 oră) şi cu anticorpi la IgG de iepure conjugaţi cu peroxidază (. diluție 1: 2000 în tampon TBST 1 oră); Fiecare dintre acești pași a fost finalizat prin spălare repetată cu tampon TBST. Membrana a fost supusă unui tratament standard cu sistemul Immune-Star (Bio-Rad, SUA).

2.3.6 Alte metode

Concentrația de proteine fracțiile au fost determinate prin metoda Bradford (Bradford, 1976) folosind albumină serică bovină (BSA) ca standard.

Densitometrie dungile pe zimograme și filmul cu raze X au fost realizate folosind programul standard „Imagine J”.

Prelucrarea datelor statistice au fost efectuate folosind metode general acceptate de statistici de variație folosind pachetele software MS Excel și StatGraphics. Semnificația diferențelor a fost evaluată cu ajutorul testului U neparametric (testul Wilcoxon-Mann-Whitney), precum și prin utilizarea analizei unidirecționale a varianței (Korosov, Gorbach, 2007).

Capitolul 3. Rezultatele cercetării și discuții

3.1. Sistemul calpaină/calpastatină la șobolani supuși neurodegenerarii induse de beta-amiloid în timpul terapiei cu estrogeni

Neurodegenerarea a fost indusă la șobolani Wistar mai în vârstă grupe de vârstă– 12 și 24 de luni. Efectul experimental a constat în administrarea intracerebrală a unui fragment cu 42 de membri a proteinei precursoare de amiloid - Abeta(1-42) (un model experimental al bolii Alzheimer), precum și administrarea intracerebrală combinată a peptidei beta-amiloid și administrarea intranazală a unui neuroprotector (estradiol). Dintre animale au fost identificate: grupul de control - operat simulat (2 μl de soluție salină în zona hipocampului drept); primul grup experimental - 2 μl de soluție de peptidă Abeta(1-42) (corespunzător la 5 μg de peptidă) în zona hipocampului drept; al doilea grup experimental - după o injecție similară cu peptida Abeta(1-42), administrarea intranazală zilnică a 0,1 mg de 17-beta-estradiol.

S-a constatat că în prezența peptidei amiloidogene în țesut nervos sistemul calpainei este activat, iar gradul de activare se corelează pozitiv cu intensitatea morții celulare a țesutului nervos (densitatea neuronilor). Reglarea calpainelor poate fi efectuată atât la nivelul sintezei proteinei enzimatice (sau a formelor sale individuale - produse ale diferitelor gene), cât și la nivel post-translațional datorită proceselor de autoliză, legându-se de inhibitorul endogen calpastatin sau la regulatorul alosteric - calciu.

Creșterea grupului de calpaine autolizate (118 kDa) detectată prin zimografie cu cazeină la grupul de animale nr. 2 reflectă activarea calpainelor in vivo. Activarea observată a m-calpainei (120 kDa), aparent, ca și în multe alte situații, este asociată cu excesul de calciu în citoplasmă. O altă confirmare a acestei căi de reglare a activității calpainei este nivelul stabil al inhibitorului lor, calpastatin, detectat în studiul nostru.

După cum sa dovedit, terapia cu estradiol inversează efectul hiperactivării calpainei, atât activitatea globală a calpainelor în țesutul nervos, cât și activitatea fracțiilor individuale scăzând. În prezența estradiolului, o proporție mai mică a precursorului calpainei suferă autoliză și, în consecință, activare. Sunt necesare studii ulterioare ale mecanismului de reglare a activității calpainei la animalele de experiment, în special, sunt necesare experimente care vizează stabilirea sursei de exces de calciu și găsirea mijloacelor de prevenire a acestor curenți patologici.

Nivelul sintezei proteazomului în țesutul cerebral este scăzut în comparație cu alte organe și tinde să scadă odată cu vârsta (când se compară indicatorii la animale de 18, 24 și 30 de luni), după cum se apreciază după cantitatea de alfa-1,2,3. ,5,6 ,7 subunități de proteazom care formează inele alfa ale particulei de bază 20S, universale pentru proteazomii 20S și 26S.

Au fost confirmate modificări ale nivelului de expresie și activitate a catepsinelor în diferite zone ale creierului la animalele de experiment. În experimentul nostru, administrarea intracerebrală a peptidei beta-amiloid a condus la o creștere semnificativă (p<0,05) экспрессии гена катепсина D в коре (правом полушарии) головного мозга крыс по сравнению с животными контрольной группы. В неокортексе крыс, которые после введения бета-амилоидного пептида получали эстрадиол, относительный уровень экспрессии данного гена не отличался от контрольных значений, то есть восстанавливался до нормального уровня. В области правого гиппокампа введение бета-амилоидного пептида привело к увеличению экспрессии гена катепсина D приблизительно в 7 раз (p<0,001). Последующее введение эстрадиола привело к еще большему возрастанию (в 30 раз) относительной экспрессии указанного гена (p<0,001).

Datele noastre au demonstrat efecte semnificative ale beta-amiloidului și estradiolului asupra performanței cognitive la șobolani evaluați folosind labirintul de apă Morris. La șobolanii femele și masculi antrenați anterior, după injectarea peptidei beta-amiloid în hipocamp, a existat o semnificativă (p<0,05) увеличилось время поиска скрытой подводной платформы. Последующее введение эстрадиола сокращало время поиска подводной платформы у животных обоих полов по сравнению с таковыми, получившими только бета-амилоид. При этом у самок время поиска уменьшилось более значимо (p<0,01), чем у самцов (p<0,05).

Rezultatele microscopiei confocale a secțiunilor creierului au arătat că administrarea de peptidă beta-amiloid a dus la o creștere semnificativă a nivelului imunoreactivității sale în țesuturile emisferei drepte și stângi (într-o măsură mai mică) a creierului. Aceste rezultate, împreună cu datele comportamentale, demonstrează eficacitatea medicamentului cu peptid amiloid administrat și oferă dovezi pentru reprezentativitatea modelului selectat al bolii Alzheimer. Administrarea ulterioară de estradiol a redus cantitatea de beta-amiloid din creierul șobolanilor până la niveluri aproape de control. Reducerea depozitelor de amiloid la șobolanii tratați cu estradiol indică declanșarea anumitor procese adaptative în țesutul nervos care vizează utilizarea lor.

Mecanismul rolului neuroprotector al estradiolului nu este încă pe deplin înțeles, deși acest fenomen a fost observat de mult timp. Utilizarea estradiolului ca neuroprotector este dictată de mai multe motive. În primul rând, efectul neuroprotector al estradiolului este destul de bine cunoscut și descris în literatură (McEwen și colab., 2001; Asimiadou și colab., 2005; Lebesgue și colab., 2009). În al doilea rând, s-a demonstrat că estradiolul este un neurosteroid în sensul deplin al cuvântului, întrucât creierul conține toate enzimele necesare sintezei sale (Stoffel-Wagner, 2001; Reddy, 2010). În al treilea rând, se știe că efectul neuroprotector al estradiolului este asociat cu efectele sale antioxidante (Behl și colab., 1997) și anti-apoptotice (Asimiadou și colab., 2005), adică cu efecte opuse celor ale peptidei Abeta.

Rezultatele obţinute pot indica un răspuns adaptativ al ţesutului nervos la introducerea unei peptide toxice. Unele publicații indică faptul că sistemul de autofagie lizozomală poate fi implicat în degradarea peptidei beta-amiloid (Nixon, 2007). Este probabil ca estradiolul să stimuleze autofagia materialului proteic; Acest lucru este evidențiat atât de datele privind conținutul de peptidă Abeta în țesutul cerebral, cât și de evaluarea activității și a nivelului de expresie a lizozom proteinazelor. Imunohistochimia fluorescentă a evidențiat o scădere a cantității de beta peptidă la șobolanii care au primit terapie neuroprotectoare cu estradiol.

Pe baza datelor obținute în experiment se pot trage următoarele concluzii. 1. Nivelul de expresie al genelor proteinazelor lizozomale CtsD, CtsB, CtsL și subunităților alfa ale proteazomilor și activitatea enzimelor pe care acestea le codifică în cortexul cerebral al șobolanilor scade odată cu îmbătrânirea. Dimpotrivă, activitatea calpainelor la animalele din grupele de vârstă mai înaintate crește. 2. Nivelul de expresie și activitate a catepsinei D, precum și intensitatea proteolizei dependente de calciu, crește semnificativ în hipocamp și cortexul cerebral la șobolani după administrarea intracerebrală a peptidei beta-amiloid, iar funcția cognitivă a animalelor are de suferit. . 3. Administrarea de estradiol pe fondul intoxicației cu beta-amiloid duce la o scădere a conținutului acestei peptide în hipocampul șobolanilor și la o îmbunătățire a indicatorilor biochimici și comportamentali la animalele de experiment. 4. Activarea farmacologică a funcției lizozomale de către estrogeni poate promova îndepărtarea Abeta în boala Alzheimer; normalizarea homeostaziei calciului în această situație previne activarea patologică a sistemului calpaină și, în același timp, pierderea neuronilor de-a lungul căilor de moarte celulară dependente de calpaină.

Cuprins

GPM.1.7.2.0022.15 Determinarea autenticității și purității medicamentelor imunobiologice prin metoda Western blot

ARTICOL FARMACOPEIAN GENERAL

Introdus pentru prima dată

Această monografie generală de farmacopee se aplică metodei Western blot, una dintre variantele imunoblotării, care este utilizată pentru a evalua autenticitatea și puritatea medicamentelor imunobiologice (IMP) bazate pe proteine ​​înalt purificate, inclusiv pe cele obținute prin tehnologia ADN recombinant.

În prima etapă, electroforeza este efectuată în gel de poliacrilamidă cu dodecil sulfat de sodiu (așa-numita electroforeză SDS-PAGE) pentru a separa proteinele. Proteinele sunt apoi transferate pe o membrană de nitroceluloză sau membrană PVDF. Detectarea se realizează utilizând anticorpi specifici proteinei detectate, conjugați cu fosfatază alcalină sau peroxidază de hrean (versiunea directă a ELISA), sau folosind secvențial primii anticorpi la proteina detectată, iar al doilea anticorp (așa-numitul ser antiglobulinic). ), primii anticorpi specifici imunoglobulinei, conjugați cu fosfatază alcalină sau peroxidază de hrean (versiunea indirectă a ELISA).

Acest OFS descrie o metodă de detectare bazată pe o reacție de culoare, ca fiind una dintre cele mai utilizate în prezent. Pentru detectare, pot fi utilizate și metode chemiluminiscente, inclusiv chemiluminiscență îmbunătățită și metode de etichete radioactive sau fluorescente (RIA sau RIF).

Testul se efectuează cu substanțe farmaceutice sau produse finite.

La evaluarea autenticității, în etapa de electroforeză, în plus față de probele de testat, în godeurile de gel trebuie adăugate următoarele soluții: o probă de control negativ (tampon de preparare a probei de 1 ori), un amestec de markeri de greutate moleculară (folosirea de se recomandă markeri de greutate moleculară pre-colorați), o probă standard din proteina testată (dacă este disponibilă), certificată în modul prescris. La evaluarea purității (impurităților), trebuie luate măsuri suplimentare pentru adăugarea unei probe cu o concentrație de proteine ​​corespunzătoare limitei de detectare sau cuantificare a impurității (în funcție de scopul metodei) și stabilită pe baza rezultatelor metodei. validare. Când se evaluează puritatea, este necesar să se compare rezultatele blot cu rezultatele electroforezei pe gel de poliacrilamidă; tehnica ar trebui să detecteze 1% impuritate.

Metodologie

Pentru a separa proteinele după greutatea lor moleculară, electroforeza este efectuată mai întâi în conformitate cu procedura descrisă în Monografia Farmacopeei Generale „Electroforeza în geluri de poliacrilamidă”.

Pentru a efectua transferul de proteine, se folosește un dispozitiv de transfer de proteine. Toate lucrările sunt efectuate folosind mănuși de cauciuc. Volumul tuturor soluțiilor utilizate trebuie să fie suficient pentru a scufunda complet membrana în care sunt transferate proteinele.

După electroforeză pentru pregătirea gelului pentru imunoblotare, acesta este umplut cu o soluție tampon pentru transferul de proteine ​​(dacă nu se indică altfel în monografia farmacopeei sau documentația de reglementare), se pune pe un agitator orbital și se păstrează timp de 10-15 minute. Se prepară apoi o foaie de nitroceluloză sau membrană PVDF corespunzătoare mărimii gelului. Când se utilizează o membrană de nitroceluloză, foaia se păstrează timp de 5 minute în apă deionizată, apoi 5 minute într-o soluție tampon pentru transferul proteinelor (dacă nu se indică altfel în monografia farmacopeei sau documentația de reglementare). Când se folosește o membrană PVDF, aceasta trebuie ținută într-o soluție de metanol sau alcool timp de 10-15 minute, apoi trebuie efectuate aceiași pași ca și pentru o membrană de nitroceluloză.

Pentru a transfera proteinele pe o membrană de nitroceluloză sau PVDF, este asamblat un „sandwich”. Pentru a face acest lucru, un burete special inclus cu dispozitivul de transfer de proteine ​​este umezit cu soluție tampon de transfer de proteine ​​și plasat pe un cadru special din plastic, pe care una până la trei foi de hârtie de filtru (de exemplu, Whatman 3MM), pre-tăiate pentru a se potrivi. dimensiunea membranei și proteinele înmuiate în soluția de transfer. Deasupra se pune un gel, pe suprafața căruia se așează cu grijă o foaie pregătită de nitroceluloză sau membrană PVDF (fără bule de aer). De la una până la trei coli de hârtie de filtru, umezite în prealabil într-o soluție de transfer de proteine, sunt așezate pe membrană și acoperite deasupra cu un al doilea burete special înmuiat într-o soluție de transfer de proteine. Cadrul este fixat cu cleme și scufundat încet într-un dispozitiv de electroforeză umplut cu o soluție de transfer de proteine, foaia de membrană ar trebui să fie îndreptată spre anod. Porniți dispozitivul. Transferul electroforetic al proteinelor se efectuează la temperatura camerei timp de 25 de minute, stabilind limita de curent la o rată de A max = 2 mA/cm 2 (de exemplu, pentru un gel care măsoară 10 × 10 cm 2 A max = 200 mA), cu excepția cazului în care se indică altfel în articolul de farmacopee sau în documentația de reglementare.

Este permisă utilizarea echipamentelor pentru transferul semi-uscat al proteinelor din gel pe membrană, în conformitate cu instrucțiunile de utilizare.

La finalizarea transferului, „sandvișul” este dezasamblat. Membrana este spălată cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS).

Completitudinea transferului de proteine ​​este evaluată vizual prin transferul de markeri colorați de greutate moleculară, toate benzile proteice principale trebuie detectate pe membrană.

Detectare

Pentru a detecta rezultatele metodei Western blot, medicamentul de testat este tratat (hibridizat) cu anticorpi. Pentru a face acest lucru, membrana cu proteinele transferate în ea este plasată într-un recipient cu o soluție tampon de blocare și incubată pe un agitator orbital timp de 30-60 de minute (cu excepția cazului în care se prevede altfel în monografia farmacopeei sau în documentația de reglementare) pentru a preveni sorbția nespecifică a anticorpi pe membrană.

După aceasta, se spală membrana într-o soluție tampon de spălare de trei ori timp de 5 minute, dacă nu se specifică altfel în monografia farmacopeei sau în documentația de reglementare.

Apoi membrana este tratată cu o soluție din primii anticorpi la proteina analizată, preparată folosind o soluție tampon pentru anticorpi (dacă nu se indică altfel în monografia farmacopeei sau în documentația de reglementare) imediat înainte de utilizare în conformitate cu instrucțiunile de utilizare. Tratamentul cu anticorpi se efectuează la temperatura camerei timp de 30-60 de minute (dacă nu se indică altfel în monografia farmacopeei sau în documentația de reglementare).

Apoi, membrana este spălată de trei ori timp de 5 minute fiecare cu o soluție tampon pentru a îndepărta anticorpii nelegați pe un agitator orbital la temperatura camerei, cu excepția cazului în care se indică altfel în monografia farmacopeei sau în documentația de reglementare.

După spălarea membranei, tratamentul (hibridizarea) se efectuează cu o soluție de al doilea anticorp. Anticorpii policlonali la imunoglobulinele speciilor de animale care au fost utilizați pentru a obține primii anticorpi sunt utilizați ca al doilea anticorp. Acești anticorpi sunt conjugați cu o enzimă (peroxidază de hrean sau fosfatază alcalină). Pentru a efectua acest pas, repetați procedura descrisă mai sus, înlocuind prima soluție de anticorpi cu o a doua soluție de anticorpi. Apoi, membrana este spălată pentru a îndepărta anticorpii doi nelegați, similar cu primul.

Dezvoltarea modelului de imunblot pe membrană se realizează cu o soluție de substrat tetrametilbenzidină (TMB) pentru anticorpi conjugați la peroxidază de hrean sau o soluție pentru dezvoltarea fosfatazei alcaline - atunci când se utilizează anticorpi conjugați la fosfatază alcalină (dacă nu se indică altfel în monografia farmacopeei sau documentaţia de reglementare).

Reacția este oprită prin spălarea blotului cu apă deionizată. Excesul de apă este îndepărtat de pe suprafața membranei cu hârtie de filtru și uscat la aer într-un loc întunecat.

Evaluarea rezultatelor

La evaluarea autenticității, benzile colorate principale de pe membrana dezvoltată ar trebui să corespundă benzilor colorate principale de pe electroferogramă.

Cantitatea de analit și conținutul de impurități, precum și raportul acestora, sunt evaluate densitometric.

Criterii de adecvare a sistemului

Rezultatele metodei Western blot pot fi luate în considerare dacă:

• markerii de greutate moleculară sunt distribuiți uniform pe toată lungimea pistei de gel corespunzătoare;
• blot-ul arată toate benzile principale identificate atunci când gelul este colorat cu Coomassie albastru strălucitor R-250 sau G-250;
• se identifică o probă cu concentrația minimă stabilită în monografia farmacopeei sau în documentația de reglementare

Criterii de acceptare a rezultatelor

• Potrivirea blotului probei de testat cu blotul probei de referință, de exemplu, proba standard corespunzătoare bazată pe proteină (substanță) purificată;
• conformitatea greutății moleculare a componentei principale identificate cu cerințele din specificație;
• conformitatea conținutului de impuritate detectată din proba etalon cu intervalul stabilit în certificatul pentru proba standard.

Metoda Western blot pentru determinarea identității și purității trebuie utilizată cu caracteristici de validare dovedite pentru specificitatea și limita de detectare a impurității.

Caracteristicile validării metodei

Atunci când se utilizează o metodologie de evaluare a autenticității, este necesar să se justifice criteriile de acceptabilitate a rezultatelor; Este recomandabil să folosiți o probă standard pe bază de proteine ​​purificate, certificată în modul prescris.

Atunci când se utilizează o metodă de evaluare a purității, este necesar să se justifice limita de detectare a impurității. La efectuarea unei determinări cantitative, este necesar să se justifice limita determinării cantitative a impurității, să se indice intervalul liniar la determinarea componentei principale și a impurităților, precizia și corectitudinea metodei. În acest scop, este recomandabil să se folosească o probă standard pe bază de proteină purificată. Atunci când sunt aduse modificări metodei specificate în monografia farmacopeei sau în documentația de reglementare, trebuie confirmate caracteristicile de validare ale metodei aprobate anterior. Următoarele modificări sunt supuse validării:

• utilizarea unui număr diferit de probe aplicate pe gel;
• modificarea condițiilor de transfer al proteinelor din gel în membrană, inclusiv schimbarea echipamentului utilizat;
• modificări în compoziția soluțiilor tampon;
• modificarea metodei de detectare a substanței de testat.

Note

1. Soluție tampon pentru transferul de proteine ​​pH 8,3. Dacă nu există alte instrucțiuni în monografia farmacopeei sau în documentația de reglementare, utilizați una dintre metodele de preparare a soluțiilor descrise mai jos (a se vedea Opțiunea 1 și Opțiunea 2). Soluția de transfer poate fi folosită de 2-3 ori. Soluția se păstrează timp de 6 luni la o temperatură de 4 până la 8 0 C.

Opțiunea 1. 7,86 g de tris(hidroximetil)aminometan, 33,75 g de glicină se pun într-un pahar gradat cu o capacitate de 3000 ml, se adaugă până la 2400,0 ml apă deionizată și se agită cu un agitator magnetic până la dizolvarea completă. Se măsoară pH-ul, care ar trebui să fie egal cu 8,3 - 8,4 (nu este permisă ajustarea pH-ului soluției cu acid sau alcali). Adăugați 600,0 ml de alcool și amestecați.

Opțiunea 2. 5,8 g de tris(hidroximetil)aminometan, 2,9 g de glicină, 11,55 ml soluție de dodecil sulfat de sodiu 10% se pun într-un pahar gradat cu o capacitate de 1000 ml, se adaugă 800,0 ml apă deionizată și se agită cu un agitator magnetic. dizolvare completă, se măsoară pH-ul (8,3-8,4). Se adaugă 200,0 ml de metanol 100% și se amestecă. Dacă se utilizează o membrană PVDF, atunci dodecilsulfatul de sodiu este exclus din soluția tampon, iar cantitatea de alcool este redusă la 100,0 ml, crescând astfel volumul de apă adăugată la 900,0 ml.

1. Soluție salină tamponată cu fosfat (PBS), pH 7,2(cu excepția cazului în care se indică altfel în monografia farmacopeei sau în documentația de reglementare). Se toarnă 4500,0 ml de apă deionizată într-un recipient gradat și se adaugă succesiv: 40,0 g clorură de sodiu, 1,0 g clorură de potasiu, 5,75 g fosfat de sodiu disubstituit 2-apos, 1,0 g sare de potasiu disubstituit (fiecare se adaugă după înlocuire). dizolvarea completă a precedentului). Setați pH-ul la 7,2 cu o soluție de acid fosforic 70% sau o soluție de hidroxid de sodiu 45%. Ajustați volumul la 5000,0 ml cu apă deionizată. Soluția se filtrează și se păstrează timp de 3 luni la o temperatură de 4 - 8 0 C.
2. Soluție tampon pentru spălare. Se adaugă 5,0 ml de soluție 10% Tween-20 într-un balon cotat de 1000 ml, se ajustează volumul soluției la semn folosind PBS și se amestecă. Soluția se păstrează timp de 1 lună la o temperatură de 4 °C până la 8 °C.
3. Soluție tampon de blocare. La 100,0 ml de soluție tampon pentru spălare, se adaugă 5,0 mg de albumină serică bovină (sau altă proteină), cu excepția cazului în care se indică altfel în monografia farmacopeei sau în documentația de reglementare și se amestecă până se dizolvă complet. Soluția se prepară înainte de utilizare.
4. Soluție tampon de anticorpi. La 100,0 ml de soluție tampon pentru spălare, se adaugă 2,0 mg de albumină serică bovină (sau alte proteine), cu excepția cazului în care se indică altfel în monografia farmacopeei sau în documentația de reglementare și se amestecă până se dizolvă complet. Soluția se prepară înainte de utilizare.

1. solutie TMB— soluție pentru dezvoltarea peroxidazei de hrean. Utilizați substrat TMB, gata de utilizare.
2. Soluție de dezvoltare de fosfatază alcalină. Se dizolvă 1 tabletă de substrat BCIP/NBT în 10,0 ml apă deionizată. Soluția se prepară imediat înainte de utilizare.