Western blot este o metodă care implică căutarea de anticorpi specifici împotriva bacteriilor, provocând boala Lyme. Ce este un test Western blot? Cum se interpretează rezultatele studiului?

Western blot este un test care caută anticorpii pe care organismul îi produce împotriva bacteriilor care cauzează boala Lyme. Pe suprafața bacteriilor există antigene împotriva cărora organismul are anticorpi specifici din clasele IgM și IgG. IgM.

Imunoglobulina M (IgM) - produsă atunci când corpul nostru întâlnește pentru prima dată un anumit agent patogen. O creștere a cantității de IgM împotriva unui anumit agent patogen indică debutul procesului bolii.

Imunoglobulina G (IgG) este produsă de organism după IgM, cel mai mult nivel înalt se realizează la aproximativ șase luni de la infecție și, spre deosebire de anticorpii IgM, pot rămâne în sânge foarte mult timp, chiar și câțiva ani.

Testul Western Blot - indicații de efectuare

Western blot este utilizat în a doua etapă de diagnosticare a borreliozei - când testul ELISA (primul test) dă un rezultat pozitiv sau echivoc. Cu toate acestea, nu este utilizat atunci când testul ELISA este în mod clar negativ.

Western blot - care este testul?

Testul Western Blot pentru borelioză (boala Lyme) evaluează cu acuratețe anticorpii la diferite fragmente de bacterii. Diversi anticorpi
împotriva fragmentelor bacteriene individuale sunt reflectate grafic ca dungi negre pe hârtie de nitroceluloză.

1. Pentru a efectua testul, sunt necesare două elemente principale: serul sanguin al pacientului și bacteriile de borelioză cultivate ucise și fragmentate.

Nu faceți acest test imediat după o mușcătură de căpușă. Așteptați cel puțin 4 săptămâni. Costul cercetării Western Blotting în ambele clase de anticorpi este de aproximativ 2500-5000 de ruble.

2. Sub influența curentului electric, distribuția are loc în factori, în primul rând bacterii obținute dintr-o cultură celulară, inclusiv proteine ​​bacteriene (antigene). Aceste proteine ​​sunt apoi transferate într-o membrană de nitroceluloză. Membrana este tăiată în benzi.

3. Banda de antigen, în combinație cu serul sanguin al pacientului, se colorează folosind tehnică specială, care detectează anticorpi legați în mod specific de antigenele Sprechete Borrelia.

4. În zonele în care anticorpii pacientului sunt legați de proteine ​​(antigeni) bacteriilor borelioze, observăm dungi caracteristice (care indică infecția cu bacterii Lyme). Rezultatul testului este pozitiv.

Fiecare banda corespunde unei proteine ​​bacteriene (antigen). Dacă proteinele și anticorpii celulei borreliozei nu se combină, banda nu va apărea. Atunci rezultatul este negativ.

Testul Western Blot - când ar trebui făcut?

Diagnosticul precoce al bolii Lyme este problematic din cauza așa-numitei ferestre serologice. Aceasta este perioada de la începutul infecției până la începutul producerii de anticorpi detectabili în organism. Pentru boala Lyme, fereastra serologică durează în medie 4 săptămâni.

Efectuarea testelor la mai puțin de 4 săptămâni după o mușcătură de căpușă prezintă riscul de a obține un rezultat fals negativ.

Test Western Blot - rezultat pozitiv

A avea anticorpi împotriva Borrelia înseamnă că aveți boala Lyme. Cu toate acestea, este dificil să răspundem la întrebarea dacă infecția este activă sau nu.

Anticorpii IgG care rezultă din infecție pot fi detectați în sânge chiar și la 10 și uneori la 20 de ani după diagnosticarea bolii Lyme.

De asemenea, se întâmplă ca anticorpii detectați clasa IgM(de obicei considerat un marker activ al infecției) poate fi persistent și, de asemenea, nu indică o infecție activă.

Test Western Blot - rezultat negativ

Testul poate da un rezultat negativ în perioada inițială a bolii, adică. În primele săptămâni după mușcătură.

Western blotting poate fi efectuat nu numai atunci când se suspectează Lyme, ci și atunci când este infectat cu H. pylori (care cauzează ulcer peptic) sau HIV.

Testul Western blot poate da un rezultat fals negativ și într-o altă situație - când într-o borelioză cronică veche s-a oprit producția de anticorpi sau când anticorpii s-au consumat complet în lupta împotriva acestei boli.

Dacă suspiciunea de boală Lyme este puternică, testul Western Blot trebuie repetat de mai multe ori, de exemplu, la câteva săptămâni, pentru a ajunge la punctul în care anticorpii sunt prezenți în sânge.

Prezența anticorpilor în boala Lyme activă variază, iar o persoană care este negativă are șanse să devină pozitivă atunci când este testată din nou câteva săptămâni mai târziu. Uneori, diagnosticul este confirmat numai după a patra sau a cincea oară.

În acest caz, unii medici încearcă să obțină confirmarea infecției într-un mod diferit: tratează pacientul cu antibiotice timp de câteva săptămâni și după 5-6 săptămâni îl trimit la Western blot.

Tratamentul cu antibiotice pentru o astfel de perioadă nu se poate vindeca boala cronica, dar se schimbă atât de mult sistemul imunitar că vor exista destui anticorpi în sânge pentru a fi detectați. Rezultatul unui test Western blot trebuie interpretat de un medic specializat în tratamentul bolii Lyme

Testul WB poate fi efectuat și în timpul terapiei antibacteriene, dar cu antibiotice probabilitatea unui rezultat pozitiv este oarecum mai puțin probabilă. Cel mai simplu mod de a diagnostica boala cu acest test este la 6 săptămâni după oprirea terapiei cu antibiotice.

Important

Interpretarea studiului este interpretarea benzilor. Ca regulă generală, trebuie să presupunem că cu cât mai multe benzi, cu atât mai fiabil diagnosticul. Trei dungi sunt într-adevăr o mare încredere, iar 5-6 dungi înseamnă boala Lyme cu probabilitate de aproape 100%.

Benzile IgM au o valoare diagnostică mai mare deoarece sugerează o fază activă a borreliozei transmise de căpușe, deși anticorpii detectați din clasa IgM (benzile IgM) pot fi persistenti și nu indică o infecție activă. Se dovedește că IgM este mare la începutul infecției și, contrar logicii, în timpul boala cronica Lyme.

Niveluri crescute de anticorpi în clasa IgG poate fi considerată o infecție reziduală sau semnifică o boală cronică activă.

Chiar și un rezultat negativ al testului nu înseamnă că boala Lyme nu este prezentă. Un rezultat negativ al testului înseamnă doar că nu există anticorpi în sânge împotriva bacteriilor borelioze - acest lucru poate apărea, de exemplu, atunci când bacteriile au intrat în organism și producția de anticorpi nu a început încă (medicii numesc această perioadă fereastra serologică) .

Din cauza varietății metodelor utilizate pentru realizarea acestui studiu, este dificil să se facă recomandări universale cu privire la interpretare. Fiecare laborator folosește propriile criterii.

Boala poate fi detectată doar de un specialist medical pe baza simptomelor și a rezultatelor testelor de laborator. Testul Wester Blot nu poate fi interpretat fără a ține cont de simptome.

Cuprins

GPM.1.7.2.0022.15 Determinarea autenticității și purității imunobiologice medicamente Metoda Western blot

ARTICOL FARMACOPEIAN GENERAL

Introdus pentru prima dată

Această monografie generală de farmacopee se aplică metodei Western blot, una dintre variantele imunoblotării, care este utilizată pentru a evalua autenticitatea și puritatea medicamentelor imunobiologice (IMP) bazate pe proteine ​​înalt purificate, inclusiv pe cele obținute prin tehnologia ADN recombinant.

În prima etapă, electroforeza este efectuată în gel de poliacrilamidă cu dodecil sulfat de sodiu (așa-numita electroforeză SDS-PAGE) pentru a separa proteinele. Proteinele sunt apoi transferate pe o membrană de nitroceluloză sau membrană PVDF. Detectarea se realizează folosind anticorpi specifici proteinei detectate, conjugați cu fosfataza alcalina sau peroxidaza de hrean (versiunea directă a ELISA), sau utilizând secvenţial primii anticorpi la proteina detectată, iar cei de-a doua anticorpi (aşa-numitul ser antiglobulinic), specifici imunoglobulinei primilor anticorpi conjugaţi cu fosfatază alcalină sau hrean peroxidază (versiunea indirectă a ELISA).

Acest OFS descrie o metodă de detectare bazată pe o reacție de culoare, ca fiind una dintre cele mai utilizate în prezent. Pentru detectare, pot fi utilizate și metode chemiluminiscente, inclusiv chemiluminiscență îmbunătățită și metode de etichete radioactive sau fluorescente (RIA sau RIF).

Testul se efectuează cu substanțe farmaceutice sau produse finite.

La evaluarea autenticității, în etapa de electroforeză, în plus față de probele de testat, în godeurile de gel trebuie adăugate următoarele soluții: o probă de control negativ (tampon de preparare a probei de 1 ori), un amestec de markeri de greutate moleculară (folosirea de se recomandă markeri de greutate moleculară pre-colorați), o probă standard din proteina testată (dacă este disponibilă), certificată în modul prescris. La evaluarea purității (impurităților), trebuie luate măsuri suplimentare pentru adăugarea unei probe cu o concentrație de proteine ​​corespunzătoare limitei de detectare sau cuantificare a impurității (în funcție de scopul metodei) și stabilită pe baza rezultatelor metodei. validare. Când se evaluează puritatea, este necesar să se compare rezultatele blot cu rezultatele electroforezei pe gel de poliacrilamidă; tehnica ar trebui să detecteze 1% impuritate.

Metodologie

Pentru a separa proteinele după greutatea lor moleculară, electroforeza este efectuată mai întâi în conformitate cu procedura descrisă în Monografia Farmacopeei Generale „Electroforeza în geluri de poliacrilamidă”.

Pentru a efectua transferul de proteine, se folosește un dispozitiv de transfer de proteine. Toate lucrările sunt efectuate folosind mănuși de cauciuc. Volumul tuturor soluțiilor utilizate trebuie să fie suficient pentru a scufunda complet membrana în care sunt transferate proteinele.

După electroforeză pentru pregătirea gelului pentru imunoblotare, acesta este umplut cu o soluție tampon pentru transferul de proteine ​​(dacă nu se indică altfel în monografia farmacopeei sau documentația de reglementare), se pune pe un agitator orbital și se păstrează timp de 10-15 minute. Se prepară apoi o foaie de nitroceluloză sau membrană PVDF corespunzătoare mărimii gelului. Când se utilizează o membrană de nitroceluloză, foaia se păstrează timp de 5 minute în apă deionizată, apoi 5 minute într-o soluție tampon pentru transferul proteinelor (dacă nu se indică altfel în monografia farmacopeei sau documentația de reglementare). Când se folosește o membrană PVDF, aceasta trebuie ținută într-o soluție de metanol sau alcool timp de 10-15 minute, apoi trebuie efectuate aceiași pași ca și pentru o membrană de nitroceluloză.

Pentru a transfera proteinele pe o membrană de nitroceluloză sau PVDF, este asamblat un „sandwich”. Pentru a face acest lucru, un burete special inclus cu dispozitivul de transfer de proteine ​​este umezit cu soluție tampon de transfer de proteine ​​și plasat pe un cadru special din plastic, pe care una până la trei foi de hârtie de filtru (de exemplu, Whatman 3MM), pre-tăiate pentru a se potrivi. dimensiunea membranei și proteinele înmuiate în soluția de transfer. Deasupra se pune un gel, pe suprafața căruia se așează cu grijă o foaie pregătită de nitroceluloză sau membrană PVDF (fără bule de aer). De la una până la trei coli de hârtie de filtru, umezite în prealabil într-o soluție de transfer de proteine, sunt așezate pe membrană și acoperite deasupra cu un al doilea burete special înmuiat într-o soluție de transfer de proteine. Cadrul este fixat cu cleme și scufundat încet într-un dispozitiv de electroforeză umplut cu o soluție de transfer de proteine, foaia de membrană ar trebui să fie îndreptată spre anod. Porniți dispozitivul. Transferul electroforetic al proteinelor se efectuează la temperatura camerei timp de 25 de minute, stabilind limita de curent la o rată de A max = 2 mA/cm 2 (de exemplu, pentru un gel care măsoară 10 × 10 cm 2 A max = 200 mA), cu excepția cazului în care se indică altfel în articolul de farmacopee sau în documentația de reglementare.

Este permisă utilizarea echipamentelor pentru transferul semi-uscat al proteinelor din gel pe membrană, în conformitate cu instrucțiunile de utilizare.

La finalizarea transferului, „sandvișul” este dezasamblat. Membrana este spălată cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS).

Completitudinea transferului de proteine ​​este evaluată vizual prin transferul de markeri colorați de greutate moleculară, toate benzile proteice principale trebuie detectate pe membrană.

Detectare

Pentru a detecta rezultatele metodei Western blot, medicamentul de testat este tratat (hibridizat) cu anticorpi. Pentru a face acest lucru, membrana cu proteinele transferate în ea este plasată într-un recipient cu o soluție tampon de blocare și incubată pe un agitator orbital timp de 30-60 de minute (cu excepția cazului în care se prevede altfel în monografia farmacopeei sau în documentația de reglementare) pentru a preveni sorbția nespecifică a anticorpi pe membrană.

După aceasta, se spală membrana într-o soluție tampon de spălare de trei ori timp de 5 minute, dacă nu se specifică altfel în monografia farmacopeei sau în documentația de reglementare.

Apoi membrana este tratată cu o soluție din primii anticorpi la proteina analizată, preparată folosind o soluție tampon pentru anticorpi (dacă nu se indică altfel în monografia farmacopeei sau în documentația de reglementare) imediat înainte de utilizare în conformitate cu instrucțiunile de utilizare. Tratamentul cu anticorpi se efectuează la temperatura camerei timp de 30-60 de minute (dacă nu se indică altfel în monografia farmacopeei sau în documentația de reglementare).

Apoi, membrana este spălată de trei ori timp de 5 minute fiecare cu o soluție tampon pentru a îndepărta anticorpii nelegați pe un agitator orbital la temperatura camerei, cu excepția cazului în care se indică altfel în monografia farmacopeei sau în documentația de reglementare.

După spălarea membranei, tratamentul (hibridizarea) se efectuează cu o soluție de al doilea anticorp. Anticorpii policlonali la imunoglobulinele speciilor de animale care au fost utilizați pentru a obține primii anticorpi sunt utilizați ca al doilea anticorp. Acești anticorpi sunt conjugați cu o enzimă (peroxidază de hrean sau fosfatază alcalină). Pentru a efectua acest pas, repetați procedura descrisă mai sus, înlocuind prima soluție de anticorpi cu o a doua soluție de anticorpi. Apoi, membrana este spălată pentru a îndepărta anticorpii doi nelegați, similar cu primul.

Dezvoltarea modelului de imunblot pe membrană se realizează cu o soluție de substrat tetrametilbenzidină (TMB) pentru anticorpi conjugați la peroxidază de hrean sau o soluție pentru dezvoltarea fosfatazei alcaline - atunci când se utilizează anticorpi conjugați la fosfatază alcalină (dacă nu se indică altfel în monografia farmacopeei sau documentaţia de reglementare).

Reacția este oprită prin spălarea blotului cu apă deionizată. Excesul de apă este îndepărtat de pe suprafața membranei cu hârtie de filtru și uscat la aer într-un loc întunecat.

Evaluarea rezultatelor

La evaluarea autenticității, benzile colorate principale de pe membrana dezvoltată ar trebui să corespundă benzilor colorate principale de pe electroferogramă.

Cantitatea de analit și conținutul de impurități, precum și raportul acestora, sunt evaluate densitometric.

Criterii de adecvare a sistemului

Rezultatele metodei Western blot pot fi luate în considerare dacă:

• markerii de greutate moleculară sunt distribuiți uniform pe toată lungimea pistei de gel corespunzătoare;
• blot-ul arată toate benzile principale identificate atunci când gelul este colorat cu Coomassie albastru strălucitor R-250 sau G-250;
• se identifică o probă cu concentrația minimă stabilită în monografia farmacopeei sau în documentația de reglementare

Criterii de acceptare a rezultatelor

• Potrivirea blotului probei de testat cu blotul probei de referință, de exemplu, proba standard corespunzătoare bazată pe proteină (substanță) purificată;
• conformitatea greutății moleculare a componentei principale identificate cu cerințele din specificație;
• conformitatea conținutului de impuritate detectată din proba etalon cu intervalul stabilit în certificatul pentru proba standard.

Metoda Western blot pentru determinarea identității și purității trebuie utilizată cu caracteristici de validare dovedite pentru specificitatea și limita de detectare a impurității.

Caracteristicile validării metodei

Atunci când se utilizează o metodologie de evaluare a autenticității, este necesar să se justifice criteriile de acceptabilitate a rezultatelor; Este recomandabil să folosiți o probă standard pe bază de proteine ​​purificate, certificată în modul prescris.

Atunci când se utilizează o metodă de evaluare a purității, este necesar să se justifice limita de detectare a impurității. La efectuarea unei determinări cantitative, este necesar să se justifice limita determinării cantitative a impurității, să se indice intervalul liniar la determinarea componentei principale și a impurităților, precizia și corectitudinea metodei. În acest scop, este recomandabil să se folosească o probă standard pe bază de proteină purificată. Atunci când sunt aduse modificări metodei specificate în monografia farmacopeei sau în documentația de reglementare, trebuie confirmate caracteristicile de validare ale metodei aprobate anterior. Următoarele modificări sunt supuse validării:

• utilizarea unui număr diferit de probe aplicate pe gel;
• modificarea condițiilor de transfer al proteinelor din gel în membrană, inclusiv schimbarea echipamentului utilizat;
• modificări în compoziția soluțiilor tampon;
• modificarea metodei de detectare a substanței de testat.

Note

1. Soluție tampon pentru transferul de proteine ​​pH 8,3. Dacă nu există alte instrucțiuni în monografia farmacopeei sau în documentația de reglementare, utilizați una dintre metodele de preparare a soluțiilor descrise mai jos (a se vedea Opțiunea 1 și Opțiunea 2). Soluția de transfer poate fi folosită de 2-3 ori. Soluția se păstrează timp de 6 luni la o temperatură de 4 până la 8 0 C.

Opțiunea 1. 7,86 g de tris(hidroximetil)aminometan, 33,75 g de glicină se pun într-un pahar gradat cu o capacitate de 3000 ml, se adaugă până la 2400,0 ml apă deionizată și se agită cu un agitator magnetic până la dizolvarea completă. Se măsoară pH-ul, care ar trebui să fie egal cu 8,3 - 8,4 (nu este permisă ajustarea pH-ului soluției cu acid sau alcali). Adăugați 600,0 ml de alcool și amestecați.

Opțiunea 2. 5,8 g de tris(hidroximetil)aminometan, 2,9 g de glicină, 11,55 ml soluție de dodecil sulfat de sodiu 10% se pun într-un pahar gradat cu o capacitate de 1000 ml, se adaugă 800,0 ml apă deionizată și se agită cu un agitator magnetic. dizolvare completă, se măsoară pH-ul (8,3-8,4). Se adaugă 200,0 ml de metanol 100% și se amestecă. Dacă se utilizează o membrană PVDF, atunci dodecilsulfatul de sodiu este exclus din soluția tampon, iar cantitatea de alcool este redusă la 100,0 ml, crescând astfel volumul de apă adăugată la 900,0 ml.

1. Soluție salină tamponată cu fosfat (PBS), pH 7,2(cu excepția cazului în care se indică altfel în monografia farmacopeei sau în documentația de reglementare). Se toarnă 4500,0 ml de apă deionizată într-un recipient gradat și se adaugă succesiv: 40,0 g clorură de sodiu, 1,0 g clorură de potasiu, 5,75 g fosfat de sodiu disubstituit 2-apos, 1,0 g sare de potasiu disubstituit (fiecare se adaugă după înlocuire). dizolvarea completă a precedentului). Setați pH-ul la 7,2 cu o soluție de 70%. acid fosforic sau o soluție de hidroxid de sodiu 45%. Ajustați volumul la 5000,0 ml cu apă deionizată. Soluția se filtrează și se păstrează timp de 3 luni la o temperatură de 4 - 8 0 C.
2. Soluție tampon pentru spălare. Se adaugă 5,0 ml de soluție 10% Tween-20 într-un balon cotat de 1000 ml, se ajustează volumul soluției la semn folosind PBS și se amestecă. Soluția se păstrează timp de 1 lună la o temperatură de 4 °C până la 8 °C.
3. Soluție tampon de blocare. La 100,0 ml de soluție tampon pentru spălare, se adaugă 5,0 mg de albumină serică bovină (sau altă proteină), cu excepția cazului în care se indică altfel în monografia farmacopeei sau în documentația de reglementare și se amestecă până se dizolvă complet. Soluția se prepară înainte de utilizare.
4. Soluție tampon de anticorpi. La 100,0 ml de soluție tampon pentru spălare, se adaugă 2,0 mg de albumină serică bovină (sau alte proteine), cu excepția cazului în care se indică altfel în monografia farmacopeei sau în documentația de reglementare și se amestecă până se dizolvă complet. Soluția se prepară înainte de utilizare.

1. solutie TMB— soluție pentru dezvoltarea peroxidazei de hrean. Utilizați substrat TMB, gata de utilizare.
2. Soluție de dezvoltare de fosfatază alcalină. Se dizolvă 1 tabletă de substrat BCIP/NBT în 10,0 ml apă deionizată. Soluția se prepară imediat înainte de utilizare.

Odată ce ADN-ul, ARN-ul sau proteinele sunt separate, acestea trebuie transferate pe un suport solid pentru detectare și alte operații care sunt dificil de făcut într-un gel. Procesul de transfer care duce la imobilizarea moleculelor , adică fixat în stare staționară se numește ştergerea (în limba engleză - ştergerea ). Ca substrat se folosesc membrane de nailon sau nitroceluloză.

Ştergerea(din engleză blotting - blotting) este o metodă de transfer a fragmentelor de ADN electroforetic pe o peliculă (membrană) specială din nitroceluloză care leagă (imobilizează) moleculele de ADN monocatenar.

Southern blot(după numele autorului care a propus-o) se bazează pe mișcarea fragmentelor de ADN datorită efectului capilar. Procesul de transfer al fragmentelor de ADN într-un gel de agaroză pe o peliculă de nitroceluloză folosind hârtie de filtru este similar cu blotarea.

Se efectuează analiza după cum urmează:

– ADN-ul izolat, purificat, denaturat și fragmentat este plasat pe o foaie de gel de agaroză, unde fragmentele sunt separate electroforetic după masă și sarcină.

– O foaie de gel de agaroză se pune pe hârtie de filtru umezită cu soluție salină concentrată (tampon).

– Apoi se aplică pe gel un filtru de nitroceluloză, unde are loc imobilizarea (sau adsorbția, sau fixarea) fragmentelor de ADN monocatenar.

– Un teanc de foi de hârtie de filtru uscată este plasat deasupra filtrului, ceea ce asigură o curgere lentă a soluției tampon prin gel (adică servește ca un fel de pompă capilară). Soluție salină, trecând printr-un gel de agaroză, poartă cu el fragmente de ADN care sunt reținute de nitroceluloză și se leagă de aceasta, iar soluția este absorbită de hârtie de filtru uscată.

– În continuare, ADN-ul este denaturat cu alcali, iar filtrul se menține în vid la o temperatură de 80 0 C, în urma căreia fragmentele de ADN monocatenar sunt imobilizate (fixate) ireversibil pe nitroceluloză. În acest caz, locația benzilor de ADN imobilizate corespunde exact cu locația lor în gel.

– ADN-ul legat de filtru este plasat într-o soluție cu o sondă marcată cu ADN, în care are loc hibridizarea. Doar fragmentele de ADN complementare acestuia se vor hibridiza (formă legături de hidrogen) cu o sondă specifică, care poate fi detectată ca dungi luminoase pe film cu raze X, adică autoradiografia unui filtru de nitroceluloză

Dot blot. Pentru a pregăti dot blots, un preparat ADN sau ARN este aplicat direct pe filtru. Picăturile de medicament arată ca niște puncte pe filtru, ceea ce explică numele tipului de blotting (punct englezesc). 1) Din ADN genomic pretratat cu ultrasunete se formează fragmente lungi de 5–10 perechi de nucleotide.

2) Pentru a face sondele ADN sau ARN accesibile sondei, acestea trebuie să fie denaturate, de exemplu. convertiți în formă cu un singur lanț. Acest lucru se întâmplă sub influența unei temperaturi de 100 °C.

3) Acizii nucleici denaturați sunt incubați pe gheață: o scădere rapidă a temperaturii împiedică renaturarea lor, adică. pereche complementară de lanțuri. ADN-ul sau ARN-ul denaturat se aplică direct pe filtru, care este incubat într-o soluție care conține sonda.

4) Pentru a preveni intrarea în soluție a acidului nucleic analizat, acesta trebuie fixat pe un filtru (membrană). Pentru aceasta se folosesc doua tipuri de filtre: nitroceluloza si nailon.

Pentru a imobiliza acizii nucleici pe un filtru de nitroceluloză, se folosește prăjirea la 80 °C în vid, iar pe un filtru de nailon se folosește iradierea UV timp de 3-5 minute.

5) După incubarea preparatului de acid nucleic cu o sondă marcată cu izotop, autoradiografia se efectuează într-o casetă specială sau identificarea folosind metode neradioactive.

Dot blotting vă permite să răspundeți la o singură întrebare: dacă secvența de nucleotide dorită este prezentă într-o probă dată.

Analiza Northern blot se aplica:

1) pentru a izola și analiza ARN (de exemplu, pentru a determina dacă ARNm citit dintr-o anumită genă este prezent într-un anumit tip de celulă, adică dacă gena este exprimată sau nu);

2) pentru a determina cantitatea acestui ARN și modificările sale în dezvoltarea unui anumit tip de celulă;

3) pentru a determina dimensiunea unei transcriere a unei gene.

În acest caz, moleculele de ARN izolate din celulă sunt separate după dimensiune utilizând electroforeza pe gel și apoi transferate într-un filtru. După hibridizare cu o sondă monocatenar marcată, sunt identificate situsurile de hibridizare (omologie) ale ARN-ului și ale sondei.

Dacă nu se cunoaște secvența de nucleotide a genei (sau ARNm) dorite, dar se cunoaște proteina a cărei sinteză o controlează, atunci este posibil să izolați o cantitate mică de proteină pură și să determinați secvența de aminoacizi a unora dintre acestea (cunoștințe). de 5–6 resturi de aminoacizi este suficient). Folosind tabelul de coduri genetice, este posibil să se stabilească toate secvențele de nucleotide posibile în secțiunea de ARNm (sau gena însăși) care codifică o anumită secvență de aminoacizi. În acest caz, o sondă poate fi sintetizată pentru a căuta clonele dorite într-o bibliotecă de gene.

Western blotinG(imunoelectroblotting, protein blotting) este o metodă de identificare a proteinelor unice. Se bazează pe fenomenul de interacțiune antigen-anticorp foarte specific. Astfel, antigenul (ținta) este proteina care se determină, iar sonda este anticorpul la aceasta.

Se obțin anticorpi la proteina studiată în diverse moduri. Cel mai simplu este să injectați o probă de proteină purificată în sângele unui animal de laborator (de obicei un iepure). Corpul său produce anticorpi (imunoglobuline) la această proteină străină. Aceștia sunt anticorpi primari care vor interacționa cu proteina țintă.

Cu toate acestea, nu ar fi rațional să se introducă o etichetă de identificare direct în datele despre anticorpi. Detectarea diferitelor proteine ​​ar necesita etichetarea diferitilor anticorpi, ceea ce ar duce la costuri ridicate. Sa dovedit a fi mai rezonabil de utilizat anticorpi universali – antiimunoglobuline conjugate, care sunt în esență anticorpi la anticorpi produși prin utilizarea proteinei identificate ca antigen. De exemplu, anti-imunoglobulinele conjugate la Ig de iepure vor interacționa cu toate imunoglobulinele sintetizate la iepuri la diferiți antigeni. Astfel, tocmai astfel de anticorpi secundari universali sunt cei care poartă o etichetă izotopică sau neradioactivă. Pe lângă o etichetă non-izotopică, care în cursul mai multor reacții duce la formarea unui compus colorat insolubil (ca în cazul blotting-ului cu acid nucleic), o etichetă chemiluminiscentă, care are o sensibilitate mai mare, este foarte des folosit.

1) Extragerea proteinelor din omogenat

2) Separarea proteinelor în funcție de greutatea moleculară folosind electroforeză în gel de poliacrilamidă SDS (PAGE). Metoda de electroforeză SDS implică denaturarea proteinelor native. Astfel, moleculele de proteine ​​cu aceeași greutate moleculară vor parcurge același drum în gel și se vor alinia sub forma unei dungi. Deoarece în amestec sunt prezente molecule de proteine ​​de diferite dimensiuni, se formează multe benzi. Rezultatele electroforezei pot fi vizualizate prin colorare cu proteine ​​(Coomassie brilliant blue, amido black, silver coloring). Colorarea cu argint are o sensibilitate unică care permite detectarea a cât mai puțin de 0,1 ng de proteină în banda rezultată. Acest lucru este foarte important pentru a controla cantitatea de proteine ​​aplicată pe gel.

3) Transferul proteinelor din gel pe membrană. Acest lucru se face deoarece poliacrilamida nu permite moleculelor mari de imunoglobuline să difuzeze în proteină. Și proteina imobilizată pe membrană devine accesibilă anticorpilor. Spre deosebire de blotarea acidului nucleic, transferul de proteine ​​către membrană are loc sub influența forțelor electrice, adică. într-un câmp electric.

4) Pata rezultată este incubată cu antiser la proteină și apoi cu antiimunoglobuline. Rezultatul este vizualizat în funcție de tipul de etichetă utilizat.

Restrictii:

1) dimensiunea mare a fragmentelor studiate, depășind semnificativ lungimea sondelor ADN și împiedicând analiza moleculară directă;

2) imposibilitatea alegerii arbitrare a capetelor secvenţelor studiate, determinată de prezenţa situsurilor de restricţie corespunzătoare în molecula originală de ADN;

3) necesitatea cantitate mare ADN genomic cu greutate moleculară mare bine purificat (cel puțin 10 μg per reacție, ceea ce este echivalent cu 0,5-1 ml de sânge),

4) pentru hibridizare genomică - prezența sondelor ADN radioactive cu activitate specifică mare de cel puțin 109 impulsuri/min * µg), care funcționează pentru o perioadă limitată de timp, și o unitate izotopică special echipată. În plus, expunerea prelungită a autografelor prelungește semnificativ timpul de obținere a rezultatelor.

5) intensitate mare a muncii cercetare

Analiza Western blot pentru a testa cantitatea de calpastatină a implicat separarea proteinelor tisulare (30 μg pe bandă) prin electroforeză în 12% PAGE în prezența SDS (Laemmli, 1970) urmată de transferul semi-uscat al polipeptidelor pe o membrană de nitroceluloză ( tampon: 48 mM Tris-HCI, 39 mM glicină, 0,0375% SDS, 20% metanol, pH 9,2). După incubarea (2 ore, 20°C) a membranei în tampon TBS (tampon Tris-HCl 50 mM, NaCI 150 mM, pH 7,5), locurile de legare nespecifice au fost blocate cu o soluție 5% de lapte degresat în tampon TBST (TBS). cu adăugarea de 0,1% Tween 20, pH 7,5) timp de 1 oră. Apoi, membrana a fost expusă secvenţial la anticorpi policlonali la calpastatină (diluţie 1: 2500 în tampon TBST; 1 oră) şi cu anticorpi la IgG de iepure conjugaţi cu peroxidază (. diluție 1: 2000 în tampon TBST 1 oră); Fiecare dintre acești pași a fost finalizat prin spălare repetată cu tampon TBST. Membrana a fost supusă unui tratament standard cu sistemul Immune-Star (Bio-Rad, SUA).

2.3.6 Alte metode

Concentrația de proteine fracțiile au fost determinate prin metoda Bradford (Bradford, 1976) folosind albumină serică bovină (BSA) ca standard.

Densitometrie dungile pe zimograme și filmul cu raze X au fost realizate folosind programul standard „Imagine J”.

Prelucrarea datelor statistice au fost efectuate folosind metode general acceptate de statistici de variație folosind pachetele software MS Excel și StatGraphics. Semnificația diferențelor a fost evaluată cu ajutorul testului U neparametric (testul Wilcoxon-Mann-Whitney), precum și prin utilizarea analizei unidirecționale a varianței (Korosov, Gorbach, 2007).

Capitolul 3. Rezultatele cercetării și discuții

3.1. Sistemul calpaină/calpastatină la șobolani supuși neurodegenerarii induse de beta-amiloid în timpul terapiei cu estrogeni

Neurodegenerarea a fost indusă la șobolani Wistar mai în vârstă grupe de vârstă– 12 și 24 de luni. Efectul experimental a constat în administrarea intracerebrală a unui fragment cu 42 de membri a proteinei precursoare de amiloid - Abeta(1-42) (un model experimental al bolii Alzheimer), precum și administrarea intracerebrală combinată a peptidei beta-amiloid și administrarea intranazală a unui neuroprotector (estradiol). Dintre animale au fost identificate: grupul de control - operat simulat (2 μl de soluție salină în zona hipocampului drept); primul grup experimental - 2 μl de soluție de peptidă Abeta(1-42) (corespunzător la 5 μg de peptidă) în zona hipocampului drept; al doilea grup experimental - după o injecție similară cu peptida Abeta(1-42), administrarea intranazală zilnică a 0,1 mg de 17-beta-estradiol.

S-a constatat că în prezența peptidei amiloidogene în țesut nervos sistemul calpainei este activat, iar gradul de activare se corelează pozitiv cu intensitatea morții celulare a țesutului nervos (densitatea neuronilor). Reglarea calpainelor poate fi efectuată atât la nivelul sintezei proteinei enzimatice (sau a formelor sale individuale - produse ale diferitelor gene), cât și la nivel post-translațional datorită proceselor de autoliză, legându-se de inhibitorul endogen calpastatin sau la regulatorul alosteric - calciu.

Creșterea grupului de calpaine autolizate (118 kDa) detectată prin zimografie cu cazeină la grupul de animale nr. 2 reflectă activarea calpainelor in vivo. Activarea observată a m-calpainei (120 kDa), aparent, ca și în multe alte situații, este asociată cu excesul de calciu în citoplasmă. O altă confirmare a acestei căi de reglare a activității calpainei este nivelul stabil al inhibitorului lor, calpastatin, detectat în studiul nostru.

După cum sa dovedit, terapia cu estradiol inversează efectul hiperactivării calpainei, atât activitatea globală a calpainelor în țesutul nervos, cât și activitatea fracțiilor individuale scăzând. În prezența estradiolului, o proporție mai mică a precursorului calpainei suferă autoliză și, în consecință, activare. Sunt necesare studii ulterioare ale mecanismului de reglare a activității calpainei la animalele de experiment, în special, sunt necesare experimente care vizează stabilirea sursei de exces de calciu și găsirea mijloacelor de prevenire a acestor curenți patologici.

Nivelul sintezei proteazomului în țesutul cerebral este scăzut în comparație cu alte organe și tinde să scadă odată cu vârsta (când se compară indicatorii la animale de 18, 24 și 30 de luni), după cum se apreciază după cantitatea de alfa-1,2,3. ,5,6 ,7 subunități de proteazom care formează inele alfa ale particulei de bază 20S, universale pentru proteazomii 20S și 26S.

Au fost confirmate modificări ale nivelului de expresie și activitate a catepsinelor în diferite zone ale creierului la animalele de experiment. În experimentul nostru, administrarea intracerebrală a peptidei beta-amiloid a condus la o creștere semnificativă (p<0,05) экспрессии гена катепсина D в коре (правом полушарии) головного мозга крыс по сравнению с животными контрольной группы. В неокортексе крыс, которые после введения бета-амилоидного пептида получали эстрадиол, относительный уровень экспрессии данного гена не отличался от контрольных значений, то есть восстанавливался до нормального уровня. В области правого гиппокампа введение бета-амилоидного пептида привело к увеличению экспрессии гена катепсина D приблизительно в 7 раз (p<0,001). Последующее введение эстрадиола привело к еще большему возрастанию (в 30 раз) относительной экспрессии указанного гена (p<0,001).

Datele noastre au demonstrat efecte semnificative ale beta-amiloidului și estradiolului asupra performanței cognitive la șobolani evaluați folosind labirintul de apă Morris. La șobolanii femele și masculi antrenați anterior, după injectarea peptidei beta-amiloid în hipocamp, a existat o semnificativă (p<0,05) увеличилось время поиска скрытой подводной платформы. Последующее введение эстрадиола сокращало время поиска подводной платформы у животных обоих полов по сравнению с таковыми, получившими только бета-амилоид. При этом у самок время поиска уменьшилось более значимо (p<0,01), чем у самцов (p<0,05).

Rezultatele microscopiei confocale a secțiunilor creierului au arătat că administrarea de peptidă beta-amiloid a dus la o creștere semnificativă a nivelului imunoreactivității sale în țesuturile emisferei drepte și stângi (într-o măsură mai mică) a creierului. Aceste rezultate, împreună cu datele comportamentale, demonstrează eficacitatea medicamentului cu peptid amiloid administrat și oferă dovezi pentru reprezentativitatea modelului selectat al bolii Alzheimer. Administrarea ulterioară de estradiol a redus cantitatea de beta-amiloid din creierul șobolanilor până la niveluri aproape de control. Reducerea depozitelor de amiloid la șobolanii tratați cu estradiol indică declanșarea anumitor procese adaptative în țesutul nervos care vizează utilizarea lor.

Mecanismul rolului neuroprotector al estradiolului nu este încă pe deplin înțeles, deși acest fenomen a fost observat de mult timp. Utilizarea estradiolului ca neuroprotector este dictată de mai multe motive. În primul rând, efectul neuroprotector al estradiolului este destul de bine cunoscut și descris în literatură (McEwen și colab., 2001; Asimiadou și colab., 2005; Lebesgue și colab., 2009). În al doilea rând, s-a demonstrat că estradiolul este un neurosteroid în sensul deplin al cuvântului, întrucât creierul conține toate enzimele necesare sintezei sale (Stoffel-Wagner, 2001; Reddy, 2010). În al treilea rând, se știe că efectul neuroprotector al estradiolului este asociat cu efectele sale antioxidante (Behl și colab., 1997) și anti-apoptotice (Asimiadou și colab., 2005), adică cu efecte opuse celor ale peptidei Abeta.

Rezultatele obţinute pot indica un răspuns adaptativ al ţesutului nervos la introducerea unei peptide toxice. Unele publicații indică faptul că sistemul de autofagie lizozomală poate fi implicat în degradarea peptidei beta-amiloid (Nixon, 2007). Este probabil ca estradiolul să stimuleze autofagia materialului proteic; Acest lucru este evidențiat atât de datele privind conținutul de peptidă Abeta în țesutul cerebral, cât și de evaluarea activității și a nivelului de expresie a lizozom proteinazelor. Imunohistochimia fluorescentă a evidențiat o scădere a cantității de beta peptidă la șobolanii care au primit terapie neuroprotectoare cu estradiol.

Pe baza datelor obținute în experiment se pot trage următoarele concluzii. 1. Nivelul de expresie al genelor proteinazelor lizozomale CtsD, CtsB, CtsL și subunităților alfa ale proteazomilor și activitatea enzimelor pe care acestea le codifică în cortexul cerebral al șobolanilor scade odată cu îmbătrânirea. Dimpotrivă, activitatea calpainelor la animalele din grupele de vârstă mai înaintate crește. 2. Nivelul de expresie și activitate a catepsinei D, precum și intensitatea proteolizei dependente de calciu, crește semnificativ în hipocamp și cortexul cerebral la șobolani după administrarea intracerebrală a peptidei beta-amiloid, iar funcția cognitivă a animalelor are de suferit. . 3. Administrarea de estradiol pe fondul intoxicației cu beta-amiloid duce la o scădere a conținutului acestei peptide în hipocampul șobolanilor și la o îmbunătățire a indicatorilor biochimici și comportamentali la animalele de experiment. 4. Activarea farmacologică a funcției lizozomale de către estrogeni poate promova îndepărtarea Abeta în boala Alzheimer; normalizarea homeostaziei calciului în această situație previne activarea patologică a sistemului calpaină și, în același timp, pierderea neuronilor de-a lungul căilor de moarte celulară dependente de calpaină.

Ştergerea(din engleza " pata" - spot) - transfer de NC, proteine ​​și lipide pe un suport solid, de exemplu, o membrană și imobilizarea acestora.

• electroforeza in gel de poliacrilamida:
o în condiții de denaturare cu adaos de uree - separarea NA-urilor scurte cu un singur lanț;
o în condiţii de denaturare cu adaos de dodecil sulfat de sodiu (electroforeza Laemmli) - separarea proteinelor după greutatea moleculară;
o în condiţii native - separarea proteinelor în funcţie de structura lor tridimensională;
• focalizare izoelectrică - pentru separarea proteinelor prin punct izoelectric (pI);
• electroforeza bidimensionala (2D) - pentru separarea proteinelor in doua directii - prin punct izoelectric si prin greutate moleculara;
• Electroforeză pe gel de agaroză - separare NC:
o pe lungimea fragmentelor liniare;
o prin „superbobinarea” moleculelor inelului;
• cromatografia în strat subțire - separarea lipidelor de complexele lipidice.

• difuzia moleculelor - transport lent, adesea folosit pentru lipide;
• blotting capilar - membrana este presată pe gel, deasupra ei se pune un teanc de hârtie de filtru, tamponul de transfer umezește gelul și se ridică sub acțiunea forțelor capilare, umezind hârtia de filtru și transferând macromoleculele din gel în membrană; blotting capilar poate fi efectuat:
o în camere cu gelul umezit cu un tampon - transfer „semisec”;
o în camere cu imersie de gel în tampon;

• vacuum blotting - similar cu capilar blotting, dar transferul este accelerat prin folosirea unui vid în locul forțelor capilare create prin umezirea hârtiei de filtru;
• electroblotting - transferul macromoleculelor încărcate pe membrană are loc sub influența unui curent electric;
• „coaserea” NC pe membrană sub influența iradierii UV sau a încălzirii - pentru fixarea finală pe membranele de nailon;
• dot blotting (slot blotting) - proba se aplică sub formă de punct sau liniuță direct pe membrană fără separarea prealabilă a moleculelor într-un gel sau pe o placă TLC.

• Membrane PVDF (fluorura de poliviniliden);
• membrane NC (nitroceluloză);
• membrane de nailon (utilizate pentru NDT).

• colorare - legarea unui colorant (ioni de argint, Coomassie, Ponceau, bromură de etidio) direct la macromoleculele detectate;
• marcarea imunochimică - marcarea macromoleculelor are loc din cauza anticorpilor marcați care se leagă în mod specific la acestea;
o imunocolorare - anticorpii sunt marcați cu coloranți, se înregistrează absorbția luminii de o anumită lungime de undă;
o imunotest enzimatic - anticorpii sunt marcați cu o enzimă, se înregistrează cantitatea de produs colorat produsă în timpul reacției enzimatice (ELISA);
o chemiluminiscent - anticorpii sunt marcați cu o enzimă reporter, care emite o strălucire în prezența unui substrat, iar emisia de lumină este înregistrată
o anumită lungime de undă;
o fluorescent - anticorpii sunt marcați cu o etichetă fluorescentă, care este excitată de lumina de o anumită lungime de undă, emisia de lumină este înregistrată în
regiune cu lungime de undă mai mare;
• marcarea radiațiilor - etichetele de radiații (radioizotopi) sunt introduse în macromolecule, detectarea se realizează folosind:
o autoradiografie (prin aplicarea de peliculă fotografică pe membrană);
o imagistica radio (determinarea cantitativă a emisiei de radiații și construirea unei imagini a poziției relative a marcajelor);
• hibridizare - legarea acizilor nucleici cu oligonucleotide marcate cu o structură complementară, de regulă, se realizează prin înregistrarea emisiei de radiație sau fluorescență a etichetei;
• spectrometrie de masă – utilizată pentru analiza structurală directă a lipidelor.

• Southern blot(Southern blotting) - numit după Edwin Southern, care a propus metoda - determinarea secvenței ADN dintr-o probă și determinarea numărului de copii ale genelor din ADN-ul genomic. Transferul pe membrană este precedat de digestia probei prin endonucleaze de restricție în fragmente și fracționarea lor prin electroforeză într-un gel de agaroză. Analiza membranei este efectuată prin hibridizare cu oligonucleotide marcate de secvenţă cunoscută;
• Northern blot- determinarea secvenței ARN din probă și studiul expresiei genelor (determinarea ARNm). Similar cu Southern blot, dar moleculele de ARN izolate din probă sunt examinate, fără digestie cu endonuclează. Separarea moleculelor se realizează într-un gel de agaroză cu adaos de formaldehidă (pentru denaturarea ARN) sau într-un gel de poliacrilamidă cu adaos de uree (utilizat pentru analiza microARN). Imobilizarea moleculelor de ARN pe membrană are loc datorită încălzirii sub vid sau „reticulare” folosind iradierea UV;
• Western blot- Imunoblotarea proteinelor este o metodă analitică utilizată pentru a identifica anumite proteine ​​dintr-o probă. Transferul pe membrană este precedat de separarea proteinelor într-un gel de poliacrilamidă. Analiza proteinelor de pe membrană se realizează imunochimic;
• far western blot- protein blotting, folosit pentru determinarea interacțiunilor proteină-proteină, asemănător Western blotting, dar în locul anticorpilor se folosesc alte proteine ​​care se leagă specific de proteina studiată;
• Southern blot- determinarea proteinelor care se leagă de ADN și a situsurilor din moleculele de ADN de care se leagă proteinele - similar cu Western blotting, dar după electroforeza de denaturare într-un gel de poliacrilamidă, proteinele sunt spălate din dodecil sulfat de sodiu în prezența ureei și sunt transferate într-un membrana de nitroceluloza prin difuzie. Ca probă se folosesc fragmente de ADN marcate de lungimi diferite, obținute prin divizarea unui fragment mai mare de ADN genomic aflat în studiu. Moleculele de ADN legate sunt apoi spălate din fiecare complex proteină-ADN și analizate prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă;
• Eastern blot- determinarea modificărilor post-translaționale ale proteinelor (lipide asociate, glicopolizaharide, reziduuri de fosfat) - asemănător Western blotting, dar anticorpii sunt folosiți nu la proteine, ci la lipide, glicopolizaharide etc. În plus față de anticorpi, alte molecule de proteine ​​care se leagă de subiecții de testat (de exemplu, lectina) sunt, de asemenea, folosite ca probe;
• blotting din Extremul Orient- analiza lipidelor separate prin cromatografie în strat subțire de înaltă performanță. Transferul pe membrană se realizează de obicei prin difuzie. Înregistrarea se realizează prin analiză structurală directă spectrometrică de masă.