10. Формирование нативной структуры белка

10.1. Внутриклеточная регуляция формирования нативной пространственной структуры белков

Синтезируемые в клетке полипептидные цепи, образованные в результате последовательного соединения аминокислотных остатков, представляют собой как бы полностью развернутые белковые молекулы. Для того, чтобы белок приобрел присущие ему функциональные свойства, цепь должна определенным образом свернуться в пространстве, сформировав функционально активную («нативную») структуру. Несмотря на громадное число теоретически возможных для отдельной аминокислотной последовательности пространственных структур, сворачивание каждого белка приводит к образованию единственной нативной конформации. Таким образом, должен существовать код, определяющий взаимосвязь между аминокислотной последовательностью полипептидной цепи и типом пространственной структуры, которую она образует. Выяснение этой взаимосвязи – нерешенная проблема, важность которой трудно переоценить. Действительно, в настоящее время уже понятно, каким образом закодированы аминокислотные последовательности в структуре ДНК, однако принципы, определяющие формирование нативной конформации белка, все еще остаются «секретом жизни». Работы по изучению сворачивания белка были начаты сравнительно недавно. Накопленная информация (главным образом основанная на результатах исследований, проведенных с растворами отдельных очищенных белков) позволила заключить, что образование пространственной структуры – процесс спонтанный, не требующий ни дополнительной информации, ни источника энергии. Предполагалось, что эти положения применимы также и для сворачивания белков внутри клетки. Однако, как это часто случается в биологии, последующие открытия заставили отказаться от такой логики; они показали, что в действительности дело обстоит значительно сложнее. Оказалось, что процесс сворачивания белка in vivo не может считаться ни спонтанным, ни энергонезависимым. Благодаря существующей внутри клетки высоко координированной системе регуляции, полипептидная цепочка с самого момента своего «рождения», сходя с рибосомы, попадает под контроль факторов, которые, не изменяя специфического пути сворачивания (определяемого генетическим кодом), обеспечивают оптимальные условия для реализации быстрого и эффективного образова-ния нативной пространственной структуры.

10.2. Образование пространственной структуры белка – процесс многостадийный

Обусловлена взаимодействием аминокислотных остатков, далеко отстоящих друг от друга в линейной последовательности. Факторы поддержания:

водородные связи

гидрофобные взаимодействия (нужны для структуры и биологических функций белка)

дисульфидные и солевые мостики

ионные и ван-дер-ваальсовы связи.

В большинстве белков на поверхности молекул находятся остатки аминокислотных радикалов, обладающих гидрофильными свойствами. УВ - радикалы, которые являются гидрофобными расположены внутри молекул. Такое распределение имеет важное значение в формировании нативной структуры и свойств белка.

В результате белки имеют гидрарную оболочку, а стабилизация третичной структуры во многом обусловлена гидрофобными взаимодействиями. Например, 25-30% аминокислотных остатков в молекулах глобулина имеют выраженные гидрофобные радикалы, 45-50% содержат ионные и полярные радикальные группы.

Боковые цепи аминокислотных остатков, которые отвечают за структуру белков различают по размеру, форме, заряду и способности образовывать водородные связи, также по химической реактивности:

алифатические боковые цепи, например, у валина, аланина. Именно эти остатки формируют гидрофобные взаимодействия.

гидроксилированные алифатические (серии, треонин). Эти аминокислотные остатки принимают участие в формировании водородных связей, а также сложных эфиров, например, с серной кислотой.

ароматические - это остатки фенилаланина, тирозина, триптофана.

аминокислотные остатки с основными свойствами (лизин, аргинин, гистидин). Преобладание в полипептидной цепи таких аминокислот придает белкам основные свойства.

остатки, обладающие кислотными свойствами (аспарагиновая и глутаминовая кислоты)

амидные (аспарагин, глутамин)

Белки, содержащие несколько полипептидных цепей, обладают четвертичной структурой. Здесь подразумевается способ укладки цепей относительно друг друга. Такие ферменты называют субъединицами. В настоящее время принято использовать термин «домен», которым обозначают компактную глобулярную единицу белковой молекулы. Многие белки состоят из нескольких таких единиц с массой от 10 до 20кДа. В белках большой молекулярной массы отдельные домены соединяются относительно гибкими участками ППЦ. В организме животных и человека присутствуют ещё более сложные структурные организации белков, примером которых могут быть мультиферментные системы, в частности пируватдекарбоксилазный комплекс.

Понятие о нативном белке

При определенных значениях рН и температуры ППЦ обладает, как правило, только одной конформацией, которая называется нативной и при которой белок в организме выполняет свою специфическую функцию. Почти всегда эта единственная конформация в энергетическом отношении преобладает над десятками и сотнями вариантов других конформаций.

Классификация. Биологические и химические свойства белков

Удовлетворительной классификации белков не существует, они условно классифицируются по пространственному строению, растворимости, биологическим функциям, физико - химическим свойствам и другим признакам.

1. по строению и форме молекул белки подразделяют на:

глобулярные (сферические)

фибриллярные(нитевидные)

2. по химическому составу делятся на:

Простые, которые состоят только из аминокислотных остатков

Сложные, имеют в составе молекулы соединения небелковой природы. Классификация сложных белков основана на химической природе небелковых компонентов.

Один из главных типов классификации:

З.по выполняемым биологическим функциям:

Ферментативный катализ. В биологических системах все химические реакции катализируются специфическими белками-ферментами. Известно более 2000

ферментов. Ферменты - мощные биокатализаторы, которые ускоряют реакцию как минимум в 1 млн. раз.

Транспорт и накопление

Перенос многих молекул небольшого размера и различных ионов часто осуществляется специфическими белками, например гемоглобином, миоглобином, которые переносят кислород. Пример накопления: ферритин накапливается в печени.

координированное движение. Белки являются основным компонентом сократительных мышц (актиновые и миозиновые волокна). Движение на микроскопическом уровне - это расхождение хромосом во время митоза, движение сперматозоидов за счёт жгутиков.

механическая опора. Высокая упругость кожи и костей обусловлена наличием фибриллярного белка - коллагена.

иммунная защита. Антитела - это высокоспецифические белки, способные узнавать и связывать вирусы, бактерии, клетки других организмов.

Генерирование и передача импульсов. Ответ нервных клеток на импульсы опосредован рецепторными белками

регуляция роста и дифференцировки. Строгая регуляция последовательности экспрессии генетической информации необходима для роста дифференцировки клеток. В любой отрезок времени жизни организма экспрессируется только небольшая часть генома клетки. Например, под действием специфического белкового комплекса формируется сеть нейронов у высших организмов.

К другим функциям пептидов и белков относят гормональные. После того как человек научился осуществлять синтез гормональных пептидов, они стали иметь исключительно важное биомедицинское значение. Пептидами являются различные антибиотики, например, валиномицин, противоопухолевые препараты. Кроме того белки выполняют функции механической защиты (кератин волос или слизистые образования, выстилающие ЖКТ или полость рта).

Основное проявление существования любых живых организмов - это воспроизведение себе подобных. В конечном итоге, наследственная информация представляет собой кодирование последовательности аминокислот всех белков организма. На здоровье человека влияют белковые токсины.

Молекулярная масса белков измеряется в дальтонах (Да) - это единица массы, практически равная массе водорода (-1,000). Термин дальтон и молекулярная масса вводятся как взаимозаменяемые. Mr большинства белков находится в пределах от 10 до 100000.

l НАТИВНОСТЬ (Natura (лат.) – природа) - это уникальный комплекс физических, физико-химических, химических и биологических свойств белковой молекулы, который принадлежит ей, когда молекула белка находится в естественном, природном (нативном) состоянии.

l Для обозначения процесса, при котором нативные свойства белка теряются, используют термин ДЕНАТУРАЦИЯ

l ДЕНАТУРАЦИЯ - это лишение белка его природных, нативных свойств, сопровождающееся разрушением четвертичной (если она была), третичной, а иногда и вторичной структуры белковой молекулы, которое возникает при разрушении дисульфидных и слабых типов связей, участвующих в образовании этих структур.

l Первичная структура при этом сохраняется, потому что она сформирована прочными ковалентными связями.

l Разрушение первичной структуры может произойти только в результате гидролиза белковой молекулы длительным кипячением в растворе кислоты или щелочи.

l ФАКТОРЫ, ВЫЗЫВАЮЩИЕ ДЕНАТУРАЦИЮ БЕЛКОВ

можно разделить на физические и химические .

Физические факторы

l Высокие температуры

l Ультрафиолетовое облучение

l Рентгеновское и радиоактивное облучение

l Ультразвук

l Механическое воздействие (например, вибрация).

Химические факторы

l Концентрированные кислоты и щелочи. Например, трихлоруксусная кислота (органическая), азотная кислота (неорганическая).

l Соли тяжелых металлов

l Органические растворители (этиловый спирт, ацетон)

l Растительные алкалоиды

l Другие вещества, способные нарушать слабые типы связей в молекулах белков.

l Воздействие факторами денатурации применяют для стерилизации оборудования и инструментов, а также как антисептики.

Обратимость денатурации

l in vitro чаще всего денатурация необратима

l In vivo, в организме, возможна быстрая ренатурация. Это связано с выработкой в живом организме специфических белков, которые «узнают» структуру денатурированного белка, присоединяются к нему с помощью слабых типов связи и создают оптимальные условия для ренатурации.

l Такие специфические белки известны как «белки теплового шока », «белки стресса » или шапероны.

l При различных видах стресса происходит индукция синтеза таких белков:

l при перегреве организма (40-440С),

l при вирусных заболеваниях,

При отравлениях солями тяжелых металлов, этанолом и др. Обратимость денатурации

В пробирке (in vitro) чаще всего это – необратимый процесс. Если же денатурированный белок поместить в условия, близкие к нативным, то он может ренатурировать, но очень медленно, и такое явление характерно не для всех белков.

In vivo, в организме, возможна быстрая ренатурация. Это связано с выработкой в живом организме специфических белков, которые «узнают» структуру денатурированного белка, присоединяются к нему с помощью слабых типов связи и создают оптимальные условия для ренатурации. Такие специфические белки известны как «белки теплового шока » или «белки стресса ».

Белки стресса

Существует несколько семейств этих белков, они отличаются по молекулярной массе.

Например, известен белок hsp 70 – heatshock protein массой 70 kDa.

Такие белки есть во всех клетках организма. Они выполняют также функцию траспорта полипептидных цепей через биологические мембраны и участвуют в формировании третичной и четвертичной структур белковых молекул. Перечисленные функции белков стресса называются шаперонными . При различных видах стресса происходит индукция синтеза таких белков: при перегреве организма (40-44 0 С), при вирусных заболеваниях, отравлениях солями тяжелых металлов, этанолом и др.

В организме южных народов установлено повышенное содержание белков стресса, по сравнению с северной расой.

Молекула белка теплового шока состоит из двух компактных глобул, соединенных свободной цепью:

Разные белки теплового шока имеют общий план построения. Все они содержат контактные домены.

Разные белки с различными функциями могут содержать одинаковые домены. Например, различные кальций-связывающие белки имеют одинаковый для всех них домен, отвечающий за связывание Ca +2 .

Роль доменной структуры заключается в том, что она предоставляет белку большие возможности для выполнения своей функции благодаря перемещениям одного домена по отношению к другому. Участки соединения двух доменов – самое слабое в структурном отношении место в молекуле таких белков. Именно здесь чаще всего происходит гидролиз связей, и белок разрушается.

Молекула белка теплового шока состоит из двух компактных глобул, соединенных свободной цепью.

Также при участии шаперонов происходит фолдинг белков при их синтезе, обеспечивая возможность принять белку нативную структуру.

Рис. 3.9. Третичная структура лактоглобулина - типичного а/р-белка (по PDB-200I) (Brownlow, S., Marais Cabral, J. H., Cooper, R., Flower, D. R., Yewdall, S. J., Polikarpov, I., North, A. C., Sawyer, L.: Structure, 5, p. 481. 1997)

Пространственная структура зависит не от длины полипептидной цепи, а от последовательности аминокислотных остатков, специфичной для каждого белка, а также от боковых радикалов, свойственных соответствующим аминокислотам. Пространственную трехмерную структуру или конформацию белковых макромолекул образуют в первую очередь водородные связи, а также гидрофобные взаимодействия между неполярными боковыми радикалами аминокислот. Водородные связи играют огромную роль в формировании и поддержании пространственной структуры белковой макромолекулы. Водородная связь образуется между двумя электроотрицательными атомами посредством протона водорода, ковалентно связанного с одним из этих атомов. Когда единственный электрон атома водорода участвует в образовании электронной пары, то протон притягивается соседним атомом, образуя водородную связь. Обязательным условием образования водородной связи является наличие хотя бы одной свободной пары электронов у электроотрицательного атома. Что касается гидрофобных взаимодействий, то они возникают в результате контакта между неполярными радикалами, неспособными разорвать водородные связи между молекулами воды, которая вытесняется на поверхность белковой глобулы. По мере синтеза белка неполярные химические группировки собираются внутри глобулы, а полярные вытесняются на ее поверхность. Таким образом, белковая молекула может быть нейтральной, заряженной положительно или же отрицательно в зависимости от pH растворителя и ионогенных групп в белке. К слабым взаимодействиям относят также ионные связи и ван-дер-ваальсовы взаимодействия. Кроме того, конформация белков поддерживается ковалентными связями S-S, образующимися между двумя остатками цистеина. В результате гидрофобных и гидрофильных взаимодействий молекула белка спонтанно принимает одну или несколько наиболее термодинамически выгодных конформаций, причем, если в результате каких-либо внешних воздействий нативная конформация нарушается, возможно полное или почти полное ее восстановление. Впервые это показал К. Анфинсен на примере каталитически активного белка рибонуклеазы. Оказалось, что при воздействии мочевиной или p-меркаптоэтанолом происходит изменение ее конформации и, как следствие, резкое снижение каталитической активности. Удаление мочевины приводит к переходу конформации белка в исходное состояние, и каталитическая активность восстанавливается.

Таким образом, конформация белков представляет собой трехмерную структуру, причем в результате ее образования многие атомы, находящиеся на удаленных участках полипептидной цепи, сближаются и, воздействуя друг на друга, приобретают новые свойства, отсутствующие у индивидуальных аминокислот или небольших полипептидов. Это так называемая третичная структура , характеризующаяся ориентацией полипептидных цепей в пространстве (рис. 3.9). Третичная структура глобулярных и фибриллярных белков существенно отличается друг от друга. Принято форму белковой молекулы характеризовать таким показателем, как степень асимметрии (отношение длинной оси молекулы к короткой). У глобулярных белков степень асимметрии равна 3-5, что касается фибриллярных белков, то эта величина у них гораздо больше (от 80 до 150).

Каким же образом первичная и вторичная развернутые структуры преобразуются в свернутую, весьма стабильную форму? Расчеты показывают, что число теоретически возможных комбинаций образования трехмерных структур белков неизмеримо больше, чем реально существующих в природе. По-видимому, основным фактором конформационной стабильности являются энергетически наиболее выгодные формы.

Гипотеза расплавленной глобулы. Одним из способов изучения сворачивания полипептидной цепи в трехмерную структуру является денатурация и последующая рснатурация белковой молекулы.

Опыты К. Анфинсена с рибонуклеазой однозначно показывают возможность сборки именно той пространственной структуры, которая была нарушена в результате денатурации (рис. 3.10).

В данном случае восстановление нативной конформации не требует наличия никаких дополнительных структур. Какие же модели свертывания полипептидной цепи в соответствующую конформацию являются наиболее вероятными? Одной из распространенных гипотез самоорганизации белка является гипотеза расплавленной глобулы. В рамках этой концепции выделяют несколько этапов самосборки белков.

• 1. В развернутой полипептидной цепи с помощью водородных связей и гидрофобных взаимодействий образуются отдельные участки вторичной структуры, служащие как бы затравками для формирования полных вторичных и супервторичных структур.
• 2. Когда число этих участков достигает определенной пороговой величины, происходит переориентация боковых радикалов и переход полипептидной цепи в новую более компактную форму, причем число нековалентных связей

Рис. 3.10.

значительно увеличивается. Характерной особенностью этой стадии является образование специфических контактов между атомами, находящимися на удаленных участках полипептидной цепи, но оказавшихся сближенными в результате образования третичной структуры.

3. На последнем этапе формируется нативная конформация белковой молекулы, связанная с замыканием дисульфидных связей и окончательной стабилизацией белковой конформации. Не исключена также неспецифическая агрегация частично сверну

тых полипсптидных цепей, что можно квалифицировать как ошибки образования нативных белков. Частично свернутая полипептидная цепь (этап 2) называется расплавленной глобулой, а этап 3 является самым медленным при образовании зрелого белка.

На рис. 3.11 показан вариант образования белковой макромолекулы, кодируемой одним геном. Известно, однако, что ряд белков, имеющих домен-

Рис. 3.11.

(по Н. К. Наградовой) ную структуру, формируется в результате дубликации генов, и образование контактов между отдельными доменами требует дополнительных усилий. Оказалось, что в клетках имеются специальные механизмы регуляции процессов сворачивания новосинтезиро- ванных белков. В настоящее время обнаружено два фермента, участвующих в реализации этих механизмов. Одной из медленных реакций третьего этапа сворачивания полипептидных цепей является *

Рис. 3.12.

Кроме того, в клетках имеется ряд каталитически неактивных белков, которые тем не менее вносят большой вклад в образование пространственных структур белков. Это так называемые шапероны и шаперонины (рис. 3.12). Один из первооткрывателей молекулярных шаперонов, Л. Эллис, называет их функциональным классом не связанных друг с другом семейств белков, которые помогают правильной нековалентной сборке других полипептидсодержа- ших структур in vivo, но не входят в состав собираемых структур и не участвуют в реализации их нормальных физиологических функций.

Шапероны помогают правильной сборке трехмерной белковой конформации путем образования обратимых нековалентных комплексов с частично свернутой полипептидной цепью, одновременно ингибируя неправильно образованные связи, ведущие к формированию функционально неактивных белковых структур. В перечень функций, свойственных шаперонам, входит защита расплавленных глобул от агрегации, а также перенос новосинтезированных белков в различные локусы клеток. Шапероны преимущественно являются белками теплового шока, синтез которых резко усиливается при стрессовом температурном воздействии, поэтому их называют еще hsp (heat shock proteins). Семейства этих белков найдены в микробных, растительных и животных клетках. Классификация шаперонов основана на их молекулярной массе, которая варьирует от 10 до 90 kDa. В основном функции шаперонов и шаперо- нинов различаются, хотя и те, и другие являются белками-помошниками процессов образования трехмерной структуры белков. Шапероны удерживают новосинтсзированную полипептидную цепь в развернутом состоянии, не давая ей свернуться в отличную от нативной форму, а шаперонины обеспечивают условия для образования единственно правильной, нативной структуры белка (рис. 3.13).

Рис. 3.13.

Шапероны / связаны с нансцентной полипептидной цепью, сходящей с рибосомы. После образования полипептидной цепи и выхода ее из рибосомы шапероны соединяются с ней и препятствуют агрегации 2. После сворачивания в цитоплазме белки отделяются от шаперона и переходят на соответствующий шаперо- нин, где и происходит окончательное образование третичной структуры 3. При помощи цитозольного шаперона белки перемещаются к внешней мембране митохондрии, где митохондриальный шапе- рон протягивает их вовнутрь митохондрий и «передает» митохондриальному шаперонину, где и происходит сворачивание 4, а 5 аналогично 4 , но применительно к эндоплазматическому ретикулуму.

Лекция 2а

2.1. Физические и химические свойства белков .

Белки, как и другие органические соединения, обладают рядом физико-химических свойств, которые обусловлены структурой их молекул.

Химические свойства белков отличаются исключительным разнообразием. Обладая аминокислотными радикалами различной химической природы, белковые молекулы способны вступать в разнообразные реакции.

2.1.1. Кислотно-осно вные свойства белковых молекул

Подобно аминокислотам, белки сочетают в себе, как осно вные , так и кислотные свойства, т. е. являются амфотерными полиэлектролитами .

В белках основной вклад в формирование кислотно-основных свойств вносят заряженные радикалы , расположенные на поверхности белковой глобулы.

Осно вные свойства белков связаны с такими аминокислотами, как аргинин , лизин и гистидин (т. е. имеют дополнительные амино- или иминогруппы).

Кислотные свойства белков связаны с присутствием глутаминовой и аспарагиновой аминокислот (имеют дополнительную карбоксильную группу).

Растворимость белков.

Каждый белок обладает определённой растворимостью, зависящей от природы самого белка и состава растворителя.

Растворимость белка зависит от:

а) аминокислотного состава, т. е. от заряда белковой молекулы: чем больше белок содержит полярных и заряженных аминокислотных радикалов, тем выше его растворимость.

б) наличия гидратного слоя (полярные и заряженные радикалы аминокислот связывают диполи воды, которые и образуют вокруг молекулы белка гидратный слой).

Добавление к водному раствору белка водоотнимающих веществ (спирт, ацетон) вызывает разрушение гидратного слоя и белок выпадает в осадок.

Денатурация белков

Специфические биологические функции белков, например ферментов или гормонов, зависят от их конформации, нарушения которой могут привести к потере биологической активности. В связи с этим, о белке, обладающем нормальной конформацией, говорят, что он находится в нативном (естественном) состоянии.

Нативный белок это белок, который обладает конформацией (пространственной структурой), обусловливающей специфическую биологическую функцию молекулы .

Довольно мягкие изменения физических условий, в том числе изменения pH, температуры или обработка водными растворами некоторых органических веществ (детергентов, этанола или мочевины), могут нарушить эту конформацию. В белках, подвергнутых таким воздействиям, происходит денатурация (Рис. 2.1 ):

Рис. 2.1. Денатурация белковой молекулы

Денатурациябелков - это разрушение четвертичной, третичной и частично вторичной структур путём разрыва слабых нековалентных взаимодействий, (водородных, ионных, гидрофобных) и дисульфидных связей, сопровождающихся потерей функции белка .

Следует различать денатурацию и деградацию белков. При деградации происходит фрагментация первичной структуры и образование фрагментов белковой макромолекулы, т. е. образуются биологически неактивные олигопептиды .

Примером денатурации белковой молекулы может служить тепловая денатурация белков в растворах при 50-60º, обусловленная разрывом нековалентных взаимодействий , при помощи которых образуется третичная структура.

Денатурация, осуществляемая в мягких условиях, часто оказывается обратимой , т. е. при удалении денатурирующего агента происходит восстановление (ренатурация ) нативной конформации белковой молекулы. Для ряда белков восстановление может быть 100%-м, причём это касается ни только водородных и гидрофобных связей, но и дисульфидных мостиков.

При обратимой денатурации восстанавливается и биологическая активность белков .

Эти данные служат дополнительным доказательством того, что вторичная и третичная структуры белков предопределены аминокислотной последовательностью.