Orenburg – 2010

1.1 Reverzibilna inhibicija

1.1.2 Nekompetitivna inhibicija

1.1.3 Nekompetitivna inhibicija

1.2 Ireverzibilna inhibicija

1.3 Alosterična inhibicija

2. Novi izgled inhibicija enzimske aktivnosti

3. Upotreba inhibitora enzima

ZAKLJUČAK

Popis korištene literature

1. Inhibitori enzima. Vrste inhibicije aktivnosti enzima

Poznato je da se aktivnost enzima može relativno lako smanjiti različitim utjecajima. Ovo smanjenje brzine enzimskih reakcija obično se naziva inhibicija aktivnosti ili inhibicija enzima.

Slika 1. Shema aktivacije i inhibicije djelovanja enzima (prema Yu. B. Filippovichu): a. – alosterički centar enzima; K - katalitički centar; c - središte podloge

Enzimi su proteini, stoga se njihova aktivnost može smanjiti ili potpuno eliminirati utjecajima koji dovode do denaturacije proteina (grijanje, izlaganje koncentrirane kiseline, lužine, soli teških metala, itd.) Ova nespecifična supresija aktivnosti enzima, koja je važna u proučavanju enzimskih reakcija, nije od posebnog interesa za proučavanje njihovog mehanizma. Mnogo je važnije proučavanje inhibicije pomoću tvari koje specifično i obično u malim količinama stupaju u interakciju s enzimima - inhibitori enzima. Dešifriranje mehanizama mnogih bioloških procesa, kao što su glikoliza, Krebsov ciklus i drugi, postalo je moguće samo kao rezultat upotrebe specifičnih inhibitora različitih enzima (N.E. Kucherenko, Yu.D. Babenyuk i sur., 1988.).

Neki inhibitori enzima su učinkovite ljekovite tvari za životinjski i ljudski organizam, drugi su smrtonosni otrovi (V.P. Komov, V.N. Shvedova, 2004.).

Inhibitori stupaju u interakciju s aktivnim središtima molekule enzima, inaktivirajući funkcionalne skupine proteina. Oni mogu stupiti u interakciju s metalima koji su dio molekula enzima i kompleksa enzim-supstrat, inaktivirajući ih. Visoke koncentracije inhibitora uništavaju kvaternarnu, tercijarnu i sekundarnu strukturu molekule enzima, uzrokujući njegovu denaturaciju (A.I. Kononsky, 1992).

Nedavno su otkriveni antienzimi (antienzimi, ili antizimi), koji su proteini koji djeluju kao inhibitori enzima. Takve tvari uključuju, na primjer, inhibitor tripsina koji se nalazi u zrnu soje i antitripsin u serumu. Antienzim ornitin dekarboksilaza nedavno je otkriven u životinjskoj jetri. Antizimi najvjerojatnije stvaraju komplekse koje je teško razdvojiti s odgovarajućim enzimima, isključujući ih iz kemijske reakcije. Ponekad je inhibitor integralna komponenta prekursora enzima ili je dio složenih enzimskih kompleksa. Međutim, još nije razjašnjeno jesu li takvi antienzimi pravi inhibitori ili regulacijske podjedinice.

Ako inhibitor uzrokuje postojane promjene u prostornom tercijarna struktura molekule enzima ili modifikacije funkcionalnih skupina enzima, tada se ova vrsta inhibicije naziva ireverzibilnom. Češće se, međutim, javlja reverzibilna inhibicija, koja se može kvantificirati pomoću Michaelis-Mentenove jednadžbe. Reverzibilna inhibicija se pak dijeli na kompetitivnu i nekonkurentnu

U praksi, mnogi inhibitori ne pokazuju svojstva karakteristična za čisto kompetitivnu ili čisto nekompetitivnu inhibiciju. Drugi način klasifikacije inhibitora temelji se na prirodi njihovog veznog mjesta. Neki od njih se vežu na enzim na istom mjestu gdje se nalazi supstrat (u katalitičkom centru), dok se drugi vežu na znatnoj udaljenosti od aktivnog centra (u alosteričnom centru) (R. Murray, D. Grenner i sur., 1993).

1.1 Reverzibilna inhibicija

Postoje tri vrste reverzibilne inhibicije enzima: kompetitivna, nekompetitivna i nekompetitivna, ovisno o tome može li se inhibicija enzimske reakcije prevladati povećanjem koncentracije supstrata ili ne.

1.1.1 Natjecateljska inhibicija

Kompetitivni inhibitor natječe se sa supstratom za vezanje na aktivno mjesto, ali za razliku od supstrata, kompetitivni inhibitor vezan za enzim ne prolazi enzimatsku konverziju. Posebnost Kompetitivna inhibicija je da se može eliminirati ili oslabiti jednostavnim povećanjem koncentracije supstrata. Na primjer, ako je pri danim koncentracijama supstrata i kompetitivnog inhibitora aktivnost enzima inhibirana za 50%, tada možemo smanjiti stupanj inhibicije povećanjem koncentracije supstrata.

U svojoj trodimenzionalnoj strukturi kompetitivni inhibitori obično nalikuju supstratu određenog enzima. Zahvaljujući toj sličnosti kompetitivni inhibitor uspijeva “prevariti” enzim i stupiti u kontakt s njim. Kompetitivna inhibicija može se kvantitativno proučavati na temelju Michaelis-Mentenove teorije. Kompetitivni inhibitor I jednostavno se reverzibilno veže za enzim E, stvarajući s njim kompleks

Kompetitivnu inhibiciju najlakše je eksperimentalno prepoznati određivanjem utjecaja koncentracije inhibitora na ovisnost početne brzine reakcije o koncentraciji supstrata. Kako bi se razjasnilo pitanje o kakvoj se vrsti - kompetitivnoj ili nekompetitivnoj - javlja reverzibilna inhibicija enzima, koristi se metoda dvostrukih recipročnih vrijednosti. Iz grafova konstruiranih u dvostrukim inverznim koordinatama također je moguće odrediti vrijednost konstante disocijacije kompleksa inhibitora enzima (vidi sliku 1) (A. Leninger, 1985.)

Kompetitivnu inhibiciju mogu uzrokovati tvari koje imaju strukturu sličnu strukturi supstrata, ali malo drugačiju od strukture pravog supstrata. Ova se inhibicija temelji na vezanju inhibitora na (aktivno) mjesto vezanja supstrata (vidi sliku 2).

Riža. 2. Opće načelo konkurentska inhibicija (shema prema V.L. Kretovichu). E - enzim; S - podloga; P 1 i P 2 - produkti reakcije; I - inhibitor.

Primjer je učinak malonske kiseline na reakciju koju katalizira sukcinat dehidrogenaza i povezana je s pretvorbom jantarne kiseline u fumarnu kiselinu. Dodavanje malonske kiseline u reakcijsku smjesu smanjuje ili potpuno zaustavlja enzimatsku reakciju jer je kompetitivni inhibitor sukcinat dehidrogenaze. Sličnost malonske kiseline sa sukcinatnom kiselinom dovoljna je za stvaranje kompleksa s enzimom, ali ne dolazi do razgradnje tog kompleksa. Kada se koncentracija jantarne kiseline poveća, ona istiskuje malonsku kiselinu iz kompleksa, kao rezultat toga, aktivnost sukcinat dehidrogenaze se obnavlja.

Riža. 3. Kompetitivna inhibicija reakcije pretvorbe sukcinatne kiseline u fumarnu kiselinu pod utjecajem malonske kiseline.

Strukture supstrata (sukcinat) i inhibitora (malonat) ipak se donekle razlikuju. Stoga se oni natječu za vezanje na aktivno mjesto, a stupanj inhibicije bit će određen omjerom koncentracija malonata i sukcinata, a ne apsolutnom koncentracijom inhibitora. Stoga se inhibitor može reverzibilno vezati za enzim, tvoreći kompleks enzim-inhibitor. Ova vrsta inhibicije ponekad se naziva inhibicija metaboličkog antagonizma (vidi sliku 3).

U općem obliku, reakcija između inhibitora i enzima može se prikazati sljedećom jednadžbom:

Rezultirajući kompleks, nazvan kompleks enzim-inhibitor EI, za razliku od kompleksa enzim-supstrat ES, ne razgrađuje se u produkte reakcije.

Mnogi lijekovi kompetitivno inhibiraju ljudske i životinjske enzime. Na primjer, ono za liječenje nekih zarazne bolesti uzrokovane bakterijama, koriste se sulfonamidni lijekovi. Pokazalo se da su ti lijekovi strukturno slični para-aminobenzoevoj kiselini, koju bakterijska stanica koristi za sintezu folne kiseline, koja je sastavni dio bakterijski enzimi. Zbog te strukturne sličnosti, sulfonamid blokira djelovanje enzima istiskujući para-aminobenzojevu kiselinu iz kompleksa s enzimom koji sintetizira folna kiselina, što dovodi do inhibicije rasta bakterija.

Peptidoglikanska struktura bakterijske stanične stijenke uključuje D-alanin, koji je odsutan u tijelu životinja i ljudi. Za sintetiziranje stanične stijenke bakterije koriste enzim alanin racemazu za pretvaranje životinjskog L-alanina u D oblik. Alanin racemaza je karakteristična za bakterije i ne nalazi se kod sisavaca. Stoga predstavlja dobru metu za inhibiciju lijekovi. Supstitucijom jednog od protona metilne skupine s fluorom nastaje fluoroalanin koji se veže na alanin racemazu, što dovodi do njezine inhibicije.

Inhibicija enzima

Vjerojatnije je da će lijekovi inhibirati aktivnost enzima

Kovalentna (kemijska) modifikacija

Aktivacija protein kinaze A pomoću cAMP

Kovalentna modifikacija uključuje reverzibilno dodavanje ili uklanjanje specifične skupine, čime se mijenja aktivnost enzima. Najčešće je takva skupina fosforna kiselina, rjeđe metilna i acetilna skupina. Fosforilacija enzima događa se na ostacima serina i tirozina. Dodavanje fosforne kiseline bjelančevinama obavljaju enzimi protein kinaze, cijepanje – proteinske fosfataze.

Promjena aktivnosti enzima
tijekom fosforilacije-defosforilacije

Enzimi mogu biti aktivni i u fosforiliranom i u defosforiliranom stanju. Na primjer, enzimi glikogen fosforilaza i glikogen sintaza se fosforiliraju kada tijelo treba glukozu, a glikogen fosforilaza postaje aktivan i počinje razgradnja glikogena i glikogen sintaze neaktivan. Kada je potrebno sintetizirati glikogen, oba enzima se defosforiliraju, sintaza postaje aktivna, a fosforilaza postaje neaktivna.

Ovisnost aktivnosti metaboličkih enzima
glikogena od prisutnosti fosforne kiseline u strukturi

U medicini se aktivno razvijaju i koriste spojevi koji mijenjaju aktivnost enzima kako bi se regulirala brzina metaboličkih reakcija i smanjila sinteza određenih tvari u tijelu.

Inhibicija aktivnosti enzima obično se naziva inhibicija, no to nije uvijek točno. Inhibitor je tvar koja uzrokuje specifično smanjenje aktivnosti enzima. Dakle, anorganske kiseline i teški metali nisu inhibitori, ali jesu inaktivatore, budući da smanjuju aktivnost bilo kojeg enzima, tj. djelovati nespecifičan.

Mogu se razlikovati dva glavna smjera inhibicije

Na temelju snage vezanja enzima na inhibitor dolazi do inhibicije reverzibilan I nepovratan.

Na temelju omjera inhibitora i aktivnog središta enzima inhibicija se dijeli na natjecateljski I nenatjecateljski.

S ireverzibilnom inhibicijom dolazi do vezanja ili uništavanja funkcionalnih skupina enzima potrebnih za očitovanje njegove aktivnosti.

Na primjer, tvar diizopropil fluorofosfat veže se snažno i nepovratno na hidroksi skupinu serina u aktivnom mjestu enzima acetilkolinesteraza, hidrolizirajući acetilkolin u živčanim sinapsama. Inhibicija ovog enzima sprječava razgradnju acetilkolina u sinaptičkoj pukotini, zbog čega transmiter nastavlja djelovati na svoje receptore, što nekontrolirano pojačava kolinergičku regulaciju. Borbeno oružje djeluje na sličan način. organofosfati(sarin, soman) i insekticidi(karbofos, diklorvos).

Neke tvari uzrokuju nepovratne inhibicija enzima. Pogledajmo dva primjera ove vrste.

Vrlo niske koncentracije iona teških metala, poput iona žive (Hg2+), srebra (Ag+) i arsena (As+), kao i određenih spojeva koji sadrže jod potpuno inhibiraju neke enzime. Te se tvari ireverzibilno spajaju sa sulfhidrilnim skupinama (-SH) u molekuli enzima (slika 4.13), a sulfhidrilne skupine mogu se nalaziti i na aktivnom mjestu enzima i izvan njega. U svakom slučaju dolazi do poremećaja strukture enzima i on gubi sposobnost kataliziranja. Također može doći do taloženja enzimskog proteina.

Još primjer ireverzibilne inhibicije- djelovanje diizopropil fluorofosfata (DFP), spoja iz skupine živčanih otrova. DPP se veže na aminokiselinski ostatak serina koji se nalazi na aktivnom mjestu enzima acetilkolinesteraze. Ovaj enzim deaktivira acetilkolin, koji ima ulogu neurotransmitera. Jedna od funkcija acetilkolina je osigurati prijenos živčanih impulsa s jednog neurona na drugi kroz sinaptičku pukotinu.

Gotovo odmah nakon prijenosa sljedećeg puls acetilkolinesteraze inaktivira acetilkolin, cijepajući svoje molekule. Ako adetilkolinesteraza je inhibirana, tada se acetilkolin nakuplja, živčani impulsi slijede jedan za drugim, a mišić se dugo ne opušta. Na kraju dolazi do paralize i može nastupiti smrt jer su zahvaćeni i mišići. prsa, što dovodi do respiratornog zastoja. Neki od insekticida koji se trenutno koriste (npr. paration) imaju isti učinak na insekte. Nervozna i mišićni sustav Također mogu naškoditi ljudima.

Alosterički enzimi

Jedan od najčešćih načina regulacije metaboličkih putova je regulacija putem alosterički enzimi. Alosteričan su enzimi čije je djelovanje “po definiciji” povezano s promjenom oblika (alios - drugačiji, drugi; stereos - oblik).

Djelovanje takvih enzima regulirano je tvarima koje djeluju kao nekompetitivni inhibitori. Te se tvari vežu za enzime na posebnim mjestima udaljenim od aktivnog centra i mijenjaju aktivnost enzima, uzrokujući reverzibilnu promjenu u strukturi aktivnog centra.

Kao rezultat toga, mijenja se i sposobnost supstrata da se veže na enzim (po čemu se ovaj fenomen razlikuje od nekonkurentna inhibicija). Tvari koje tako djeluju nazivaju se alosterički inhibitori. Slika objašnjava mehanizam alosterične inhibicije.

Primjer ovaj fenomen je reakcija koja se događa tijekom glikolize, koja je jedna od faza staničnog disanja. Stanično disanje služi kao izvor ATP-a. Ako je koncentracija ATP visoka, tada ATP, djelujući kao alosterički inhibitor, inhibira aktivnost jednog od glikolitičkih enzima. Ako se stanični metabolizam poveća, pa se stoga ATP troši i njegova ukupna koncentracija pada, tada nakon uklanjanja inhibitora ovaj metabolički put ponovno stupa na snagu. Ovo također može poslužiti kao primjer inhibicije krajnjeg proizvoda.

Djelovanje enzima može biti potpuno ili djelomično potisnuto (inhibirano) određenim kemikalijama - inhibitori (slika 8).

Po prirodi svoga djelovanja inhibitori dijele se na reverzibilni i nepovratni. Ova podjela se temelji na jačini veze između inhibitora i enzima.

Reverzibilni inhibitori su veze koje nekovalentno stupaju u interakciju s enzimom i mogu se odvojiti od enzima.

natjecateljski. Kompetitivni inhibitor natječe se sa supstratom za vezanje na mjestu aktivnog mjesta vezanja supstrata i veže se za enzim na sličan način kao supstrat. Ali kompetitivni inhibitor vezan za enzim ne prolazi kroz enzimatsku konverziju. Posebnost kompetitivne inhibicije je da se može oslabiti ili potpuno eliminirati povećanje koncentracije supstrata. Mnogi lijekovi su kompetitivni inhibitori enzima.

Primjer. Sulfa lijekovi koji se koriste za liječenje zaraznih bolesti. Sulfonamidi su strukturni analozi para-aminobenzojeve kiseline iz koje se u stanici mikroorganizma sintetizira koenzim (H 4 - folat) koji sudjeluje u biosintezi nukleinskih baza. Kršenje sinteze nukleinskih kiselina dovodi do smrti mikroorganizama.

Reverzibilna inhibicija može biti nenatjecateljski u odnosu na podlogu; u tom slučaju inhibitor se ne natječe sa supstratom za isto mjesto u enzimu.

Nekompetitivni inhibitor može se vezati na enzim u prisutnosti ili odsutnosti supstrata; povećanje koncentracije supstrata ne sprječava vezanje inhibitora (slika 9). Nekompetitivni inhibitor zapravo smanjuje količinu aktivnog enzima.

Vezanje dovodi do promjene konformacije enzima i poremećaja komplementarnosti sa supstratom. Nekompetitivni inhibitori mogu se reverzibilno vezati i na slobodni enzim i na ES kompleks. Najvažniji nekompetitivni inhibitori su intermedijarni produkti metabolizma koji nastaju u živoj stanici i koji se mogu reverzibilno vezati na određena mjesta enzima (alosteričke centre) i mijenjati njihovu aktivnost, što je jedan od načina regulacije metabolizma.

Ireverzibilni inhibitori - to su spojevi koji mogu specifično vezati određene funkcionalno važne skupine aktivnog centra, tvoreći kovalentne, jake veze s enzimom. Pritom se ireverzibilno, često kovalentno, vežu za enzim ili kompleks enzim-supstrat i nepovratno mijenjaju nativnu konformaciju. Djelovanje nekih otrovnih tvari temelji se na inhibiciji aktivnosti enzima, na primjer, spojevi arsena, Hg 2+, Pb 2+

Primjer Diizopropil fluorofosfat inhibira enzime koji imaju serin u aktivnom mjestu. Takav enzim je acetilkolinesteraza, koja katalizira sljedeću reakciju:

Reakcija se događa svaki put kada se provede živčani impuls, prije nego što se drugi impuls prenese kroz sinapsu. Diizopropil fluorofosfat je jedan od otrovnih živčanih agenasa, jer dovodi do gubitka sposobnosti neurona da provode živčane impulse.

Primjer. Terapeutski učinak aspirina kao antipiretika i protuupalnog sredstva objašnjava se činjenicom da aspirin inhibira jedan od enzima koji katalizira sintezu prostaglandina (PG). Prostaglandini su tvari koje sudjeluju u razvoju upale. Inhibicija je posljedica kovalentne modifikacije jedne od amino skupina enzima - prostaglandin sintetaze.

Inhibicija enzima. Inhibitor je tvar koja uzrokuje specifičan smanjena aktivnost enzima. Mora se razlikovati između inhibicije i inaktivacije. Inaktivacija je npr. denaturacija proteina kao rezultat djelovanja denaturirajućih sredstava.

Snagom vezivanja inhibitor s enzima inhibitori se dijele na reverzibilne i ireverzibilne.

Ireverzibilni inhibitoričvrsto su vezani i uništavaju funkcionalne skupine molekule enzima, koje su potrebne za ispoljavanje njegove katalitičke aktivnosti. Svi postupci pročišćavanja proteina ne utječu na vezanje inhibitora i enzima. Primjer: djelovanje organofosfornih spojeva na enzim kolinesterazu. Klorofos, sarin, soman i drugi organofosforni spojevi vežu se na aktivno središte kolinesteraze. Kao rezultat toga dolazi do fosforilacije katalitičkih skupina aktivnog centra enzima. Zbog toga se molekule enzima povezane s inhibitorom ne mogu vezati na supstrat i dolazi do ozbiljnog trovanja.

Također istaknuti reverzibilni inhibitori, na primjer proserin za kolinesterazu. Reverzibilna inhibicija ovisi o koncentraciji supstrata i inhibitora i uklanja se viškom supstrata.

Po mehanizmu djelovanja istaknuti:

Natjecateljska inhibicija;

Nekompetitivna inhibicija;

Inhibicija supstrata;

Alosterički.

1) Kompetitivna (izosterična) inhibicija- To je inhibicija enzimske reakcije uzrokovana vezanjem inhibitora na aktivno središte enzima. U ovom slučaju, inhibitor je sličan supstratu. Pritom dolazi do kompeticije za aktivno središte: nastaju kompleksi enzim-supstrat i inhibitor-enzim. E+S®ES® EP® E+P; E+I® E. Primjer: reakcija sukcinat dehidrogenaze [Sl. COOH-CH 2 -CH 2 -COOH® (iznad strelice SDH, ispod FAD®FADN 2) COOH-CH=CH-COOH]. Pravi supstrat ove reakcije je sukcinat (jantarna kiselina). Inhibitori: malonska kiselina (COOH-CH 2 -COOH) i oksaloacetat (COOH-CO-CH 2 -COOH). [riža. enzim s 3 rupe + supstrat + inhibitor = kompleks inhibitora s enzimom]

Primjer: enzim kolinesteraza katalizira pretvorbu acetilkolina u kolin: (CH 3) 3 -N-CH 2 -CH 2 -O-CO-CH 3 ® (iznad strelice CHE, ispod - vode) CH 3 COOH+ (CH 3 ) 3 - N-CH2 -CH2 -OH. Kompetitivni inhibitori su prozerin i sevin.

2) Nekompetitivna inhibicija– inhibicija povezana s utjecajem inhibitora na katalitičku transformaciju, ali ne i na vezanje enzima na supstrat. U tom slučaju, inhibitor se može vezati i na aktivno mjesto (katalitičko mjesto) i izvan njega.

Dodatak inhibitora izvan aktivnog centra dovodi do promjene konformacije (tercijarne strukture) proteina, uslijed čega se mijenja konformacija aktivnog centra. To utječe na katalitičko mjesto i ometa interakciju supstrata s aktivnim mjestom. U ovom slučaju inhibitor nije sličan supstratu i ta se inhibicija ne može ukloniti viškom supstrata. Moguće je stvaranje ternarnih kompleksa enzim-inhibitor-supstrat. Brzina takve reakcije neće biti maksimalna.

Nekompetitivni inhibitori uključuju:

Cijanidi. Oni se vežu za atom željeza u citokrom oksidazi i, kao rezultat toga, enzim gubi svoju aktivnost, a zbog Ovo je enzim respiratornog lanca, tada je disanje stanica poremećeno i one umiru.

Ioni teških metala i njihovi organski spojevi (Hg, Pb i dr.). Mehanizam njihova djelovanja povezan je s njihovom vezom s različitim SH skupinama. [riža. enzim sa SH grupama, živin ion, supstrat. Sve se to spaja u trostruki kompleks]

Niz farmakoloških sredstava koja bi trebala utjecati na enzime malignih stanica. Ovo također uključuje inhibitore koji se koriste u poljoprivreda, otrovne tvari u kućanstvu.

3) Inhibicija supstrata (nekompetitivna)– inhibicija enzimske reakcije uzrokovane viškom supstrata. Nastaje kao rezultat stvaranja kompleksa enzim-supstrat koji nije u stanju podvrći se katalitičkoj transformaciji. Može se ukloniti i smanjiti koncentraciju supstrata. [riža. vezanje enzima na 2 supstrata odjednom]